Ядро человека: Ядро клетки — все статьи и новости

NXF1–NXT1 в клетках насекомых проводили так же, как и для комплекса THO (см. выше). Клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали в буфере L (50 мМ HEPES, pH 7,9, 300 мМ NaCl, 10% (масса/объем) глицерина, 1 мМ DTT, полная смесь ингибиторов протеазы без ЭДТА) перед обработкой ультразвуком. Лизат клеток подвергали ультрацентрифугированию, а супернатант наносили на колонку HisTrap HP объемом 5 мл, уравновешенную в буфере М (25 мМ HEPES, pH 7,9, 300 мМ NaCl, 10% (вес/объем) глицерина, 30 мМ имидазола, 1 мМ ДТТ).Колонку промывали 45 мМ имидазолом и элюировали буфером М, содержащим 300 мМ имидазола. Пиковые фракции разбавляли 1:2 буфером М, не содержащим имидазола и содержащим 5% (вес/объем) глицерина и 10 мМ NaCl, и загружали в колонку HiTrap Heparin HP 5 мл (GE Healthcare), уравновешенную в буфере N (25 мМ HEPES pH 7,9, 50 мМ NaCl, 5% (вес/объем) глицерина, 1 мМ ДТТ). Комплекс элюировали линейным градиентом буфера N от 50 до 1000 мМ NaCl. Фракции, содержащие гетеродимер NXF1-NXT1, концентрировали до 1 мг/мл ^-1 , мгновенно замораживали и хранили при -80°C.

FG-повтор NUP214 (остатки 1916–2033) экспрессировали в клетках насекомых, как это сделано для комплекса THO, описанного выше. Собранные клетки лизировали ультразвуком в буфере А и наносили на 5 мл колонку HisTrap HP, уравновешенную в буфере В. Колонку промывали буфером В, а затем буфером В, содержащим 600 мМ NaCl. Белок элюировали буфером В, содержащим 300 мМ имидазол, и подвергали диализу в течение ночи против 1 л буфера С, содержащего 200 мМ NaCl. Диализованный белок наносили на колонку HiLoad 16/600 Superdex 200 пг, уравновешенную в буфере С, содержащем 200 мМ NaCl.Фракции, содержащие белок NUP214 FG-repeat, объединяли, концентрировали до 14 мг/мл ^-1 , мгновенно замораживали и хранили при -80°C.

Комплект Infinium CoreExome-24 | ДНК-микрочип для крупных генетических исследований

Возможности автоматизации	Автоматический загрузчик массивов, роботы для обработки жидкостей	Автоматический загрузчик массивов, роботы для обработки жидкостей	Автоматический загрузчик массивов, роботы для обработки жидкостей	Автоматический загрузчик массивов, роботы для обработки жидкостей	Автоматический загрузчик массивов, роботы для обработки жидкостей
Описание	Включает в себя все теги SNP, найденные на Infinium Core-24 BeadChip, плюс более 240 000 маркеров от Infinium Exome-24 BeadChip , с возможностью добавления до 100 000 полунастраиваемых маркеров для экономичные широкомасштабные исследования генотипирования.	Экономичный массив для генотипирования нового поколения, который позволяет популяционная генетика, трансляционные исследования, скрининг вариантов исследований и исследований в области точной медицины, сочетая высокооптимизированные мультиэтнический полногеномный контент, кураторские варианты клинических исследований и маркеры контроля качества.	Предлагает более 274 000 функциональных экзонических маркеров, обеспечивая высокую покрытие предполагаемых функциональных экзонических вариантов, выбранных из более 12 000 отдельных экзомных и полногеномных последовательностей для изучения новых ассоциации с признаками и болезнями.	Объединяет более 2,5 миллионов тегов SNP из HapMap и 1000 геномов проекты (> 2,5% MAF) с > 240 000 маркеров из Infinium Массив Exome-24 BeadChip, позволяющий проводить полногеномные исследования вариаций, в то же время максимальное покрытие функциональных экзонических SNP.	Массив высокой плотности, обеспечивающий охват общих, промежуточных и редкие SNP с использованием функционального экзонного контента для полногеномного генотипирования и исследования вариаций количества копий.
Количество маркеров	Фиксированные маркеры: 567 218, емкость дополнительных маркеров: до 100 000 (с вариантами + комплект)	Фиксированные маркеры: ~ 654 027 Емкость дополнительных маркеров: до 100 000	Фиксированные маркеры: 958 497, емкость дополнительных маркеров: до 30 000	Фиксированные маркеры: 2 618 000, емкость дополнительных пользовательских маркеров: нет	Фиксированные маркеры: 4 548 474, емкость дополнительных пользовательских маркеров: нет
Количество образцов	24 выборки на массив	24 выборки на массив	8 выборок на массив	8 выборок на массив	4 выборки на массив
Пропускная способность	~2304 образца в неделю (оценка для 1 системы iScan, 1 автозагрузчика 2. х, 2 Infinium Automated Pipetting Systems и 5-дневная рабочая неделя)	~5760 образцов в неделю на iScan (пропускная способность и время сканирования могут различаться) в зависимости от конфигурации лаборатории и системы.)	~960 образцов в неделю (оценка для 2 систем iScan, 1 AutoLoader 2.x, 2 Infinium Automated Pipetting Systems и 5-дневная рабочая неделя)	~1728 образцов в неделю на iScan (максимальная пропускная способность и время сканирования могут варьироваться на основе конфигурации лаборатории и системы)	~544 образца в неделю (оценка для 2 систем iScan, 1 AutoLoader 2.х, 3 Infinium Automated Pipetting Systems и 5-дневная рабочая неделя)
Категория видов	Человек	Человек	Человек	Человек	Человек

Особенности последовательности ядерных промоторов дрожжей и человека, которые предсказывают максимальную активность промотора | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Коровой промотор — это область, в которой РНК-полимераза II рекрутируется в ДНК и действует для инициации транскрипции, но степень, в которой последовательность корового промотора определяет уровни активности промотора, в значительной степени неизвестна. Здесь мы идентифицировали несколько особенностей содержания оснований и последовательности k-mer в последовательности основного промотора дрожжей, которые в высокой степени предсказывают максимальную активность промотора. Эти особенности в основном расположены в области 75 п.н. выше и 50 п.н. ниже основного сайта начала транскрипции, и их ассоциации сохраняются как для конститутивно активных промоторов, так и для промоторов, которые индуцируются или репрессируются в определенных условиях. Наши результаты раскрывают несколько архитектурных особенностей промоторов ядра дрожжей и предполагают, что последовательность промотора ядра дрожжей ниже TATA-бокса (или подобных последовательностей, участвующих в рекрутировании комплекса пре-инициации) является основным фактором, определяющим максимальную активность промотора.Далее мы показываем, что основные промоторы человека также содержат признаки, указывающие на максимальную активность промотора; таким образом, наши результаты подчеркивают важную роль основной последовательности промотора в регуляции транскрипции.

ВВЕДЕНИЕ

Основной промотор РНК-полимеразы II (pol-II) представляет собой область, в которой pol-II рекрутируется в ДНК и действует для инициации транскрипции, процесса, в котором участвуют общие факторы транскрипции (GTF, включая следующие: TFIIA, TFIIB, TFIID , TFIIE, TFIIF, TFIIH) ( 1 ).

Первым идентифицированным основным промоторным элементом был бокс ТАТА (1), сайт связывания ТАТА-связывающего белка (TBP; субъединица TFIID), который обнаружен у всех эукариот. Большинство промоторов ядра дрожжей не содержат консенсусного ТАТА-бокса (2). Недавнее исследование показало, что почти все промоторы дрожжей содержат последовательности, которые отличаются от консенсуса TATA-бокса до 2 оснований, и что TBP рекрутируется на такие последовательности с меньшей аффинностью (3). У многоклеточных животных (например, человека, дрозофилы) другие основные промоторные элементы (Inr, DPE и т. д.) были идентифицированы (4), выявляя различные архитектуры основных промоторов. Эти элементы не обнаружены в промоторах ядра дрожжей. У многоклеточных животных, как и у дрожжей, большинство основных промоторов не имеют ТАТА-бокса (4). Однако, поскольку ТАТА-бокс является наиболее известным элементом, в который рекрутируется пре-инициаторный комплекс (PIC), большая часть наших знаний об инициации транскрипции основана на ТАТА-боксе, содержащем основные промоторы.

Основное различие между инициацией транскрипции у дрожжей и многоклеточных животных заключается в выборе сайта начала транскрипции (TSS).У многоклеточных животных формирование PIC над TATA-боксом приводит к отбору TSS на 25-30 п.н. ниже его, в то время как у Saccharomyces cerevisiae выбранные TSS находятся на 40-120 п.н. ниже TATA-бокса (1). Как у дрожжей, так и у многоклеточных животных было показано, что плавление промоторной ДНК происходит примерно на 20 п.н. ниже ТАТА-бокса (5), так что промоторная последовательность примерно на 30 п.н. ниже ТАТА-бокса находится в активном центре pol-II (6, 7). ). Другое исследование предположило, что после образования PIC дрожжевой pol-II выполняет нисходящее сканирование расплавленной нити матрицы в поисках сигналов последовательности TSS (5).Эта модель сканирования подтверждается исследованиями, показывающими, что места TSS могут быть на разном расстоянии ниже места, где происходит набор PIC (например, блок TATA), и зависит от последовательности в этих местах (8–13). Различные исследования также показали, что TFIIB, TFIIF и TFIIH влияют на выбор TSS в зависимости от последовательности, следующей за TSS и выше нее (14-17). Предлагаемые консенсусные последовательности TSS дрожжей включают RRY RR, TCRA (9), YAWR (18) и A(A _Rich ) ₅ NY A WNN(A _Rich ) ₆ (19).

Многочисленные данные свидетельствуют о том, что изменение последовательности ТАТА-бокса изменяет уровни активности промотора (20-26). Однако роль нижестоящих сигналов последовательности основного промотора дрожжей, которые могут влиять на сканирование pol-II и селекцию TSS в определении уровней активности промотора, изучена меньше. В одном исследовании был проанализирован набор из 95 промоторов S. cerevisiae и было отмечено, что последовательность 30–10 п.н. выше TSS была обогащена T и обеднена A, тогда как последовательность между 8 п.н. выше и 15 п.н. ниже TSS была T-обеднена. и обогащенный А (27).Они назвали этот базовый сигнал контента «локатором», предполагая, что он может влиять на локализацию TSS. Они показали, что сигнал «локатора» был сильнее у 51 «сильного» промотора по сравнению с 34 «слабыми». Их результаты дополняют более раннее исследование, в котором проанализировано 17 промоторов S. cerevisiae и отмечено существование богатого пиримидином отрезка, оканчивающегося примерно на 10 п.н. выше TSS в шести высокоэкспрессирующих промоторах (28). Другое исследование продемонстрировало высокую эффективность основного TSS гена SNR14 и количественно определило, в какой степени различные мутации снижали его эффективность, приводя к снижению продукции мРНК (12).

Здесь мы намеревались исследовать взаимосвязь между различным содержанием оснований и k-мерными характеристиками последовательности промотора ядра дрожжей и активностью промотора. Мы обнаружили, что несколько признаков указывают на максимальную активность промотора, как у конститутивно активных промоторов, так и у промоторов, которые индуцируются или репрессируются в определенных условиях. Большинство этих особенностей расположены в пределах 75 п.н. выше и 50 п.н. ниже основного TSS и представляют собой сигналы основного промотора, расположенные ниже места, в которое рекрутируется PIC.Это говорит о том, что последовательность промотора ядра дрожжей может сильно влиять на активность промотора, влияя на скорость сканирования pol-II и выбор TSS. Распространяя наше исследование на конститутивные TSS человека, мы показываем, что у человека, как и у дрожжей, особенности основного промотора указывают на максимальную активность промотора. Взятые вместе, наши результаты показывают, что основной промотор является важной детерминантой активности промотора.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Прогнозы средней занятости внутренних нуклеосом

Мы предсказали внутреннюю среднюю занятость нуклеосом вокруг TSS дрожжей, используя модель, опубликованную (29), с параметром температуры, установленным на 1, и масштабированием нуклеосом (параметр, связанный с концентрацией), установленным на 0. 5. Прогнозы были сделаны для фланкированных последовательностей длиной 1000 п.н. вокруг TSS, чтобы избежать ошибок, связанных с краями последовательности.

В то время как in vitro – измеренная средняя заселенность является внутренней, она измеряется с концентрацией нуклеосом намного ниже, чем in vivo , и поэтому неадекватно отражает внутреннюю среднюю заселенность in vivo . Используя приведенные выше параметры, средняя предсказанная внутренняя средняя заполняемость по всему геному S. cerevisiae была немного больше 0.6.

Обучение линейной модели

Мы решили изучить линейную модель по нескольким причинам. Во-первых, линейные модели просты и легко интерпретируются. Во-вторых, для данных о дрожжах у нас есть <1 тыс. точек данных, но начальный набор > 54 тыс. признаков. Это требует эффективного выбора признаков; в противном случае переподгонка модели к обучающим данным неизбежна. Вместо того, чтобы выполнять выбор признаков перед обучением модели, алгоритмы регуляризованной линейной регрессии позволяют изучать относительно разреженные модели, которые могут избежать или, по крайней мере, уменьшить переоснащение.

Нашим предпочтительным алгоритмом линейной регрессии была эластичная сеть (30), налагающая комбинацию L ₁ и L ₂ условий регуляризации. Термин L ₁ способствует разреженности, тогда как член L ₂ способствует распределению веса между несколькими ковариатами. Для обучения эластичной сети по обучающим данным мы использовали программу glmnet (http://www-stat.stanford.edu/∼tibs/glmnet-matlab/ ). Мы выбрали соотношение смешивания 1:1 между условиями L ₁ и L ₂ ( glmnet параметр α = 0,5). Чтобы обеспечить относительную разреженность, мы ограничили количество ненулевых размеров эффекта до 200 (параметр glmnet df _max = 200). Мы говорим, что признак был включен в модель, если величина его эффекта не равна нулю.

glmnet использует регрессию по наименьшему углу ( 31 ) для создания сетки решений на пути регуляризации вектора коэффициентов модели между нулевой моделью и нерегуляризованной моделью. Каждое решение на пути регуляризации соответствует определенному значению коэффициента регуляризации λ , причем λ монотонно уменьшается между нулевой моделью и нерегуляризованной моделью (где λ = 0). Чтобы выбрать значение λ , мы использовали схему 10-кратной перекрестной проверки (CV) по обучающим данным. Для этой цели обучающая выборка была случайным образом разделена (10 раз) на внутреннюю обучающую выборку и проверочную выборку. Для каждого внутреннего обучающего набора мы изучили сетку из до 1000 решений (параметр glmnet nlambda = 1000) на пути регуляризации и взяли значение λ решения, которое показало наилучшие результаты на отложенном проверочном наборе. (по статистике R ² ).Окончательное значение λ было принято как среднее значение 10 выбранных значений λ .

РЕЗУЛЬТАТЫ

Особенности последовательности основного промотора сильно различаются между

. cerevisiae

В недавнем исследовании, проведенном в нашей лаборатории (будет опубликовано в другом месте), 859 нативных промоторов S. cerevisiae были вставлены выше репортерного гена YFP, и их промоторная активность была точно измерена в 10 различных условиях.Многие из этих генов конститутивно экспрессировались во всех условиях, и мы будем называть их здесь конститутивными генами. Мы будем называть все остальные гены регулируемыми генами, поскольку каждый из них дополнительно индуцируется или репрессируется в подмножестве условий. Эта первая классификация генов связана с их способом регуляции. Мы альтернативно классифицировали гены на основе их максимальной промоторной активности. В качестве приближения к реальной максимальной активности промотора (в любых возможных условиях) мы использовали максимальную измеренную активность промотора, обозначенную E _max и классифицированную следующим образом: низкая ( E _max < 0. 1), средние (0,1 ≤ E _max < 0,4), высокие (0,4 ≤ E _max < 1) и очень высокие ( E _max ≥ 1). По определению, это приближение является более точным для генов с высокими значениями E _max и может быть менее точным для генов с низкими значениями E _max , поскольку они могут сильно экспрессироваться в условиях, отличных от 10 осмотрел. В общей сложности у нас было 729 генов из вышеперечисленных 859, для которых также был измерен их TSS (32) (см. Дополнительную таблицу S1).Применяя оба вышеупомянутых критерия классификации, мы разделили эти 729 генов на восемь подмножеств: 171 конститутивно-низкий (как конститутивный, так и низкий), 104 регулируемых-низких, 190 конститутивных-средних, 80 регулируемых-средних, 122 конститутивных-высоких, 18 регулируемых. – высокая, 36 конститутивная – очень высокая и 8 регулируемая – очень высокая.

Для каждого из восьми вышеупомянутых подмножеств генов мы проанализировали содержание оснований (мононуклеотидов и G + C) и совпадения консенсуса TATA-бокса TATAWAWR ( 2 ) в области между 200 п. н. выше и 100 п.н. ниже основного TSS ( обозначает область [-200, 100]), как показано (32).

Поразительно, но мы обнаружили, что гены с более высокими значениями E _max имеют основные промоторные последовательности, которые значительно (см. Сумма рангов P -значения на дополнительном рисунке S1) более богаты T (рисунок 1 и дополнительный рисунок S1A) вверх по течению от основного TSS (в пределах области [-70, -10]) и, попеременно, более богатое A (рисунок 1 и дополнительный рисунок S1B) в и ниже по течению от основного TSS (в пределах области [0, 50]). Аналогичный результат был показан (27) для меньшего набора генов (см. выше).Здесь мы также показываем, что этот сигнал очень похож как для конститутивных, так и для регулируемых генов, которые имеют сходные уровни E _max .

Рисунок 1.

Сигналы последовательности основного промотора дрожжей различаются между генами с разной максимальной активностью промотора. Среднее содержание нуклеотидов и ТАТА-боксов, рассчитанное с использованием скользящего окна (длина 20 п. н., шаг 10 п.н.) по области [-200, 100] вокруг основного TSS (32) для восьми подмножеств генов дрожжей (определено в основном тексте). ).Здесь содержимое окна TATA-бокса было определено как доля генов в подмножестве, которые имели совпадение с консенсусом TATA-бокса TATAWAWR (2) в пределах окна (попадание засчитывалось, если первый T был в окне). Сюжеты расположены в виде таблиц. Столбцы расположены по максимальному уровню активности промоторов генов ( E _max ). Верхние три строки предназначены для конститутивных генов, а нижние три строки — для регулируемых генов. Кроме того, аналогичные графики были построены для набора всех генов (нижняя часть рисунка).Вертикальные пунктирные линии обозначают расположение основного TSS. Горизонтальные пунктирные линии предназначены для облегчения сравнения графиков между столбцами.

Рисунок 1.

Сигналы последовательности основного промотора дрожжей различаются между генами с разной максимальной активностью промотора. Среднее содержание нуклеотидов и ТАТА-боксов, рассчитанное с использованием скользящего окна (длина 20 п.н., шаг 10 п.н.) по области [-200, 100] вокруг основного TSS (32) для восьми подмножеств генов дрожжей (определено в основном тексте). ).Здесь содержимое окна TATA-бокса было определено как доля генов в подмножестве, которые имели совпадение с консенсусом TATA-бокса TATAWAWR (2) в пределах окна (попадание засчитывалось, если первый T был в окне). Сюжеты расположены в виде таблиц. Столбцы расположены по максимальному уровню активности промоторов генов ( E _max ). Верхние три строки предназначены для конститутивных генов, а нижние три строки — для регулируемых генов. Кроме того, аналогичные графики были построены для набора всех генов (нижняя часть рисунка).Вертикальные пунктирные линии обозначают расположение основного TSS. Горизонтальные пунктирные линии предназначены для облегчения сравнения графиков между столбцами.

Гены с более высокими значениями E _max (как конститутивными, так и регулируемыми) также имеют тенденцию иметь значительно более низкое содержание G\C вокруг их основного TSS (рисунок 1 и дополнительный рисунок S1C). Интересно, что сниженное содержание G\C вокруг основного TSS генов с высоким E _max в основном достигается за счет значительного снижения содержания G (рисунок 1 и дополнительный рисунок S1D), а не содержания C (рисунок 1).Известно, что содержание G\C сильно коррелирует с внутренней заполненностью нуклеосом (33), которая зависит только от последовательности ДНК и концентрации гистоновых белков. Было показано, что эта внутренняя занятость хорошо предсказывается термодинамической моделью, основанной на данных о занятости in vitro нуклеосом (29). Используя эту модель, мы предсказали и рассчитали среднюю занятость внутренних нуклеосом вокруг основного TSS (см. раздел «Материалы и методы») для восьми определенных выше наборов генов, показанных на рисунке 2A.Действительно, существует сходство между дорожками содержания G\C (Рисунок 1) и предсказанными дорожками внутренней занятости нуклеосом, предполагая, что более низкая внутренняя занятость нуклеосомами вокруг основного TSS способствует более высоким уровням максимальной активности промотора. Эта тенденция также очевидна при изучении средней занятости нуклеосом YPD in vivo (29), показанной на рисунке 2B, хотя для регулируемых генов, многие из которых не индуцируются при YPD (с доступной глюкозой), существуют значительные различия между YPD in vivo и предсказанное внутреннее заселение нуклеосом.

Рисунок 2.

Занятость нуклеосомами основных промоторов дрожжей различается между генами с разной максимальной активностью промоторов. ( A ) Среднее предсказанное заполнение нуклеосомами в области [-200, 100] вокруг основной TSS для восьми подмножеств генов дрожжей (определено в основном тексте). Прогнозы были сделаны с помощью модели (29) с параметрами, которые давали среднюю геномную занятость нуклеосом ~0,6 (обозначена пунктирными горизонтальными линиями). Сюжеты расположены в виде таблиц.Столбцы расположены по максимальному уровню активности промоторов генов ( E _max ). Верхний ряд предназначен для конститутивных генов, а нижний ряд — для регулируемых генов. Вертикальные пунктирные линии обозначают расположение основного TSS. ( B ) Среднее значение in vivo (YPD) нормализованной оккупации нуклеосом (29). Y — значение оси 1 (горизонтальные пунктирные линии) представляет среднее значение генома.

Рисунок 2.

Занятость нуклеосомами основных промоторов дрожжей различается между генами с разной максимальной активностью промоторов.( A ) Среднее предсказанное заполнение нуклеосомами в области [-200, 100] вокруг основной TSS для восьми подмножеств генов дрожжей (определено в основном тексте). Прогнозы были сделаны с помощью модели (29) с параметрами, которые давали среднюю геномную занятость нуклеосом ~0,6 (обозначена пунктирными горизонтальными линиями). Сюжеты расположены в виде таблиц. Столбцы расположены по максимальному уровню активности промоторов генов ( E _max ). Верхний ряд предназначен для конститутивных генов, а нижний ряд — для регулируемых генов. Вертикальные пунктирные линии обозначают расположение основного TSS. ( B ) Среднее значение in vivo (YPD) нормализованной оккупации нуклеосом (29). Y — значение оси 1 (горизонтальные пунктирные линии) представляет среднее значение генома.

Консенсус TATA-боксы, как известно, являются сайтами связывания TBP с высокой аффинностью, при этом одно и два несоответствия приводят к более слабой аффинности связывания (3). В соответствии с (2), при сравнении регулируемых и конститутивных генов, имеющих сходные значения E _max , мы обнаружили более высокую частоту консенсусных ТАТА-боксов (рис. 1) в основных промоторах регулируемых генов.Тем не менее, как для регулируемых, так и для конститутивных генов частота консенсусных ТАТА-боксов выше в генах с более высоким E _max . Это подтверждает высокоаффинное связывание TBP, способствующее более высокой экспрессии (26).

Таким образом, эти результаты идентифицируют несколько специфических сигналов последовательности сердцевинного промотора, которые являются прогнозирующими и, таким образом, могут влиять на максимальную промоторную активность дрожжевых промоторов.

Богатство T перед основным TSS является предиктором максимальной активности промотора

Затем мы попытались проверить, в какой степени признаки последовательности основного промотора могут предсказывать уровни E _max .С этой целью мы сосредоточились на сигнале T-богатства перед основным TSS (рис. 1). Для каждого из наших скользящих окон (длина 20 п.н., шаг 10 п.н.) в области [-80, -1] мы рассчитали для каждого промотора соотношение содержания Т к содержанию А\Т в этом окне и взяли максимум за эти значения. окна, чтобы быть значением функции T-richness. Взятие отношения содержания T к содержанию A\T, а не самого содержания T, нормализует различия в содержании A\T между конститутивными и регулируемыми генами с подобными E _max .Затем для каждой пары подмножеств генов (из восьми вышеперечисленных) мы вычислили показатель AUC, определяющий степень, в которой наш признак T-богатства разделяет гены одного подмножества и другого подмножества. Оценка 0,5 достигается случайным образом, а оценка 1 представляет собой идеальное разделение (классификацию). Преимущество представления оценок AUC по сравнению с P -значениями (например, тестов суммы рангов) заключается в том, что P -значений очень чувствительны к размерам сравниваемых подмножеств генов, в то время как показатели AUC — нет.Вычисленные показатели AUC показаны на рисунке 3 в виде треугольной цветовой матрицы. Каждое пересечение строки и столбца содержит оценку AUC того, насколько хорошо функция T-богатства разделяет подмножество справа от строки и подмножество в начале столбца. Для каждой оценки AUC мы также проверили, значительно ли она отличается от 0,5, вычислив эмпирическое значение P на основе 10 000 случайных перестановок значений признаков. Оценка AUC с незначимым значением P (контролируется для допуска ложного обнаружения, равного 0.05) отмечены знаком «х».

Рисунок 3.

Богатство Т перед основным TSS является предиктором максимальной активности промоторов дрожжей. Оценки AUC для отделения генов одного подмножества генов дрожжей от другого на основе признака T-богатства выше основного TSS (вверху справа, см. Также основной текст). Оценки AUC показаны в треугольной цветовой матрице, где каждая ячейка содержит оценку для отделения подмножества генов в начале столбца от подмножества генов справа от строки.Баллы, незначительно отличающиеся от 0,5 (на основе эмпирического значения P , контролируемого для допуска FDR, равного 0,05), отмечены знаком «x». Для четырех баллов степень разделения двух подмножеств генов дополнительно демонстрируется путем сравнения распределения значений признаков двух подмножеств. Кон = Учредительный; Рег = регулируемый.

Рис. 3.

Богатство T перед основным TSS является предиктором максимальной активности промоторов дрожжей. Оценки AUC для отделения генов одного подмножества генов дрожжей от другого на основе признака T-богатства выше основного TSS (вверху справа, см. Также основной текст).Оценки AUC показаны в треугольной цветовой матрице, где каждая ячейка содержит оценку для отделения подмножества генов в начале столбца от подмножества генов справа от строки. Баллы, незначительно отличающиеся от 0,5 (на основе эмпирического значения P , контролируемого для допуска FDR, равного 0,05), отмечены знаком «x». Для четырех баллов степень разделения двух подмножеств генов дополнительно демонстрируется путем сравнения распределения значений признаков двух подмножеств.Кон = Учредительный; Рег = регулируемый.

Мы обнаружили два важных наблюдения. Во-первых, свойство T-богатства существенно не различается между парами подмножеств генов (конститутивными и регулируемыми) одного и того же уровня E _max . Во-вторых, в большинстве случаев признак T-богатства может значительно разделить подмножества генов, которые имеют разные уровни E _max , и мера разделения (AUC) увеличивается по мере увеличения разницы в уровнях E _max . .Из этого правила есть четыре исключения (конститутивное — среднее по сравнению с конститутивным — низким, регулируемое — среднее по сравнению с регулируемым — низким, регулируемое — высокое по сравнению с регулируемым — средним и регулируемое — очень высокое по сравнению с регулируемым — высоким), где разделение слабое и незначительное.

В совокупности эти результаты показывают, что определенная выше характеристика T-богатства является предиктором уровня E _max гена.

Предсказание максимальной активности промотора на основе признаков основной последовательности промотора

Вдохновленные нашими вышеприведенными результатами, мы стремились изучить количественную модель, которая предсказывает E _max гена на основе особенностей его основной последовательности промотора, с двумя целями: обеспечить нижнюю границу того, насколько прогностическая область основного промотора имеет максимальную активность промотора, а также для выяснения особенностей основной последовательности промотора, которые могут играть роль в ее определении.

Для каждого из 729 генов мы рассчитали большой набор базового содержания и количества k-меров (k = 1, …, 4) и признаков существования в разных окнах в пределах [−200, 50] региона. Для каждого 4-мерного признака мы рассчитали еще одну его версию с допустимым несоответствием 4-мера до 1. Придерживаясь 10-кратной схемы CV, мы определили 10 пар обучающих и тестовых наборов генов следующим образом: мы случайным образом разделили 729 генов на 10 подмножеств (примерно) одинакового размера. Каждый раз мы брали один из 10 подмножеств в качестве тестового набора, а обучающий набор состоял из всех остальных генов.Для каждого из 10 обучающих наборов мы сначала сократили разреженные признаки (которые имели поддержку <5% генов в обучающем наборе) и использовали оставшиеся признаки (> 54 тыс.) для изучения линейной модели, которая предсказывает E. _max на основе небольшого их подмножества (см. раздел «Материалы и методы»). Затем эту модель использовали для предсказания значений E _max генов в соответствующем наборе тестов. Производительность модели оценивалась по трем показателям: статистика R ² (определяющая долю дисперсии данных, которая объясняется моделью), корреляция Пирсона, r , и корреляция Спирмена, ρ .

Средние (по 10 моделям) показатели производительности показаны на рис. 4 A (гистограмма). Что наиболее важно, среднее значение теста R ² равно 0,254, что указывает на то, что сама последовательность сердцевинного промотора может объяснить по меньшей мере 25,4% дисперсии максимальной промоторной активности дрожжевых промоторов. Разница между средней корреляцией теста Пирсона (0,527) и средней корреляцией теста Спирмена (0,425) указывает на небольшое смещение моделей для лучшего предсказания высоких значений E _max .Этого можно ожидать в таких случаях, как наш, когда распределение значений ответов сильно искажено (дополнительный рисунок S3). Сравнение средней производительности модели на обучающих данных с тестовыми данными (рис. 4A, столбчатая диаграмма) показывает, что существует определенная степень переоснащения обучающих данных. Это тоже ожидаемо, так как каждая модель изучалась на большом наборе (> 54 тыс.) функций. Поэтому мы сосредоточимся на функциях, которые были включены по крайней мере в 5 из 10 моделей (48 таких функций), поскольку они, вероятно, представляют реальные сигналы. Мы называем эти функции надежными функциями.

Рисунок 4.

Основные характеристики последовательности промотора объясняют 25% вариаций максимальной активности промотора у дрожжей. Результаты обучения линейных моделей (в 10-кратной схеме CV), которые предсказывают E _max по признакам области [−200, 50] (относительно основного TSS). ( A ) Гистограмма показывает средние показатели эффективности модели ( R ² ; корреляция Пирсона, r ; корреляция Спирмена, ρ), с планками ошибок, указывающими ±1 стандартное отклонение.Среднее значение теста R ² , равное 0,254, указывает на то, что особенности основного промотора объясняют 25,4% E _max дисперсии удерживаемых генов. Для каждого гена точечный график показывает log E _max в сравнении с предсказанием логарифмического теста (каждый ген появился в тестовом наборе для одной из 10 моделей). Логарифмическое преобразование было применено после сдвига значений ответа и тестового прогноза на константу таким образом, чтобы все значения стали положительными (откликом были значения E _max с центром вокруг 0). В таблице перечислены 48 надежных функций (включенных как минимум в 5 из 10 моделей). Каждая функция включает элемент последовательности (базовый контент, k-mer) в определенном окне. Характеристики были классифицированы вручную (крайний левый столбец) и отсортированы внутри каждого класса по средней величине их эффекта (цветовой код в крайнем правом столбце). ( B ) Иллюстрация классов признаков последовательности (с их расположением относительно основного TSS), которые предсказывают большее или меньшее значение E _max .

Рисунок 4.

Особенности последовательности основного промотора объясняют 25% вариаций максимальной активности промотора у дрожжей. Результаты обучения линейных моделей (в 10-кратной схеме CV), которые предсказывают E _max по признакам области [−200, 50] (относительно основного TSS). ( A ) Гистограмма показывает средние показатели эффективности модели ( R ² ; корреляция Пирсона, r ; корреляция Спирмена, ρ), с планками ошибок, указывающими ±1 стандартное отклонение. Среднее значение теста R ² , равное 0,254, указывает на то, что особенности основного промотора объясняют 25,4% E _max дисперсии удерживаемых генов. Для каждого гена точечный график показывает log E _max в сравнении с предсказанием логарифмического теста (каждый ген появился в тестовом наборе для одной из 10 моделей). Логарифмическое преобразование было применено после сдвига значений ответа и тестового прогноза на константу таким образом, чтобы все значения стали положительными (откликом были значения E _max с центром вокруг 0).В таблице перечислены 48 надежных функций (включенных как минимум в 5 из 10 моделей). Каждая функция включает элемент последовательности (базовый контент, k-mer) в определенном окне. Характеристики были классифицированы вручную (крайний левый столбец) и отсортированы внутри каждого класса по средней величине их эффекта (цветовой код в крайнем правом столбце). ( B ) Иллюстрация классов признаков последовательности (с их расположением относительно основного TSS), которые предсказывают большее или меньшее значение E _max .

Таблица с подробным описанием надежных функций приведена на рис. 4 A.Для каждой функции (строки) мы показываем ее элемент последовательности (например, 4-мерный «TTTT») и окно промотора (относительно основного TSS), где он был рассчитан. Примечательно, что большинство признаков может быть связано с одним из сигналов основной последовательности промотора, которые мы обсуждали выше. Основываясь на этом, мы разделили функции на несколько классов (определения классов отображаются в левом столбце) и отсортировали их внутри каждого класса по их среднему размеру эффекта (рассчитано по 10 моделям, цветовая маркировка в правом столбце).

Надежные признаки 1–11 (порядковые номера указаны в заштрихованном столбце) относятся к Т-богатым k-мерам в окнах в области [-75, -1] и имеют положительный эффект (в сторону более высоких предсказанных E _max значений), в соответствии с нашими наблюдениями выше.Примечательно, что наиболее предсказуемыми являются T-богатые k-меры в области [-20, -11], поскольку они включены как в надежные признаки 1, так и в 2, а размер их эффекта представляет собой сумму эффектов двух признаков. Надежный признак 12 также относится к богатому T 4-меру, но в небольшом окне выше по течению.

Надежные признаки 13–19 относятся к Т-менее k-мерам в области [-100, -1]. Надежные признаки 20–22 представляют собой максимальное отношение A-содержания к A\T-содержимому, взятое в скользящем окне (размер 10 п.н., шаг 5 п.н.) в пределах области [-75, -16].Надежные признаки 13–22 представляют элементы с низким содержанием Т выше по течению от основного TSS и имеют отрицательные эффекты.

Надежные признаки 23–29, вероятно, включают сигналы связывания TBP, поскольку они включают k-mers, которые являются частью консенсусного блока TATA, до 1 несоответствия (3) и находятся выше основного TSS. Интересно, что такие сигналы в пределах 100 п.н. выше основного TSS (надежные признаки 23–26) оказывают положительное влияние, в то время как сигналы, расположенные выше (надежные признаки 27–29), имеют отрицательный эффект, что позволяет предположить, что связывание TBP намного выше основного TSS менее подходит для достижения высокой промоторной активности. Это согласуется с моделью сканирования pol-II, поскольку связывание TBP намного выше основного TSS потребует более длительного сканирования pol-II и, возможно, даже увеличит вероятность падения pol-II до инициации.

Надежные элементы 30–41 находятся в окнах, перекрывающих основной TSS или немного ниже его. Эти особенности имеют положительный эффект и включают в себя содержание А (надежный признак 33), а также богатые А k-меры, которые также содержат пиримидины, и сигналы захвата, которые имеют некоторое сходство с мотивом TSS (19).

Надежный признак 42 представляет собой наличие 4-мера «AATG» в пределах 50 п.н. ниже основного TSS и имеет положительный эффект. Эта особенность может на самом деле представлять собой сигнал, связанный с трансляцией, предполагая, что короткая 5’UTR способствует более высокой скорости трансляции (напомним, что показатели активности промотора были основаны на измерениях YFP), возможно, в связи со сканированием мРНК рибосомами для первый АВГ ( 34 ). Чтобы дополнительно оценить этот результат, мы сравнили длины 5’UTR (32) четырех подмножеств генов: конститутивно-высокий, конститутивно-низкий, регулируемый-высокий и регулируемый-низкий.На рис. 5 показано кумулятивное распределение длин 5’UTR для этих четырех подмножеств. Было обнаружено, что только для генов с конститутивным высоким уровнем 5’UTR значительно короче, чем у других подмножеств (сумма рангов P -значения <10 ^{— 5} ). Это говорит о том, что длина 5’UTR действительно может влиять на экспрессию конститутивных генов, но в меньшей степени на регулируемые гены. Наш результат расширяет предыдущие результаты (35, 36), которые показали, что конститутивные гены, как правило, имеют более короткие 5’UTR, чем другие гены.

Рисунок 5.

Длина 5’UTR может влиять на экспрессию конститутивных генов. Кумулятивное распределение длин 5’UTR (32) для четырех подмножеств генов. 5’UTR конститутивно-высоких генов, как правило, короче, чем у других трех подмножеств (сумма рангов P -значения < 10 ^-5 ).

Рисунок 5.

Длина 5’UTR может влиять на экспрессию конститутивных генов. Кумулятивное распределение длин 5’UTR (32) для четырех подмножеств генов.5’UTR конститутивно-высоких генов, как правило, короче, чем у других трех подмножеств (сумма рангов P -значения < 10 ^-5 ).

Надежные признаки 43–48 содержат G\C и 4-меры, богатые G\C, в окнах вокруг основного TSS и имеют отрицательные эффекты в соответствии с приведенными выше наблюдениями.

Таким образом, используя количественный подход к моделированию, наши результаты демонстрируют, что особенности последовательности основного промотора могут объяснить большую часть дисперсии максимальной активности промотора удерживаемых генов.Мы также смогли предположить, что специфические особенности последовательности в различных частях основного промотора играют роль в определении максимальной активности промотора. Эти функции делятся на несколько классов, как показано на рисунке 4 B.

Влияние сложности и расположения функций последовательности на предсказание

Результаты линейного моделирования, о которых сообщалось в предыдущем разделе, были основаны на характеристиках основной области промотора со сложностью последовательности в диапазоне от содержания оснований до 4-меров. Возникает интересный вопрос: достаточно ли функций низкой сложности последовательности для достижения аналогичной производительности. Чтобы проверить это, мы несколько раз повторили нашу схему обучения линейной модели, начиная только с признаков базового содержания и постепенно добавляя признаки более высокой сложности последовательности, вплоть до признаков 5-меров. Среднее значение (более 10 моделей) теста R ² представлено на рисунке 6A для каждого порога сложности последовательности, демонстрируя, что использование одних только признаков базового содержимого может объяснить (в среднем)> 20% дисперсии тестовых данных.Тем не менее, увеличение сложности последовательности до 4-меров дополнительно способствовало эффективности теста, предполагая, что особенности последовательности более высокой сложности основной области промотора действительно играют дополнительную неповторяющуюся роль в определении максимальной активности промотора.

Рисунок 6.

Сравнение среднего теста R ² линейных моделей, изученных с различной сложностью/ограничениями местоположения на функциях последовательности. Здесь была применена та же схема обучения линейной модели с 10-кратной перекрестной проверкой, описанная в основном тексте и в легенде к рисунку 4.( A ) Сравнение среднего теста R ² моделей с возрастающей сложностью разрешенных для использования признаков последовательности. Использование только базовых элементов содержимого может привести к среднему результату теста R ² >0,2, но <0,254, что может быть достигнуто только в том случае, если разрешено использование признаков более высокого порядка (до 4-меров). ( B ) Сравнение среднего теста R ² моделей, в которых разрешенные для использования признаки последовательности ограничены различными окнами 100 и 50 п.н. (вокруг основного TSS).Каждое окно представлено прямоугольником над его положением, окрашенным в соответствии с его средним значением R ² . Наивысшее среднее значение теста R ² , равное 0,194, достигается для признаков в пределах [-75, 24] или в пределах [-50, 49] окон.

Рисунок 6.

Сравнение среднего теста R ² линейных моделей, изученных с различной сложностью/ограничениями местоположения на функциях последовательности. Здесь была применена та же схема обучения линейной модели с 10-кратной перекрестной проверкой, описанная в основном тексте и в легенде к рисунку 4.( A ) Сравнение среднего теста R ² моделей с возрастающей сложностью разрешенных для использования признаков последовательности. Использование только базовых элементов содержимого может привести к среднему результату теста R ² >0,2, но <0,254, что может быть достигнуто только в том случае, если разрешено использование признаков более высокого порядка (до 4-меров). ( B ) Сравнение среднего теста R ² моделей, в которых разрешенные для использования признаки последовательности ограничены различными окнами 100 и 50 п.н. (вокруг основного TSS).Каждое окно представлено прямоугольником над его положением, окрашенным в соответствии с его средним значением R ² . Наивысшее среднее значение теста R ² , равное 0,194, достигается для признаков в пределах [-75, 24] или в пределах [-50, 49] окон.

Еще один интересный вопрос заключается в том, какие области основного промотора более предсказуемы в отношении максимальной активности промотора. Чтобы пролить свет на это, мы снова повторили нашу схему обучения линейной модели несколько раз (используя признаки до 4-меров), каждый раз используя только признаки, которые попадают в определенное окно (длиной 100 или 50 п.н.) по основному промотору. область.Для каждого такого окна его результирующий средний тест R ² показан на рисунке 6 B, показывая, что достаточно взять признаки в пределах [-50, 49] или [-75, 24], чтобы объяснить 19,4% тестовой дисперсии. Действительно, большинство устойчивых признаков, которые, как было обнаружено, имеют высокие (абсолютные) эффекты (рис. 4 A), были рассчитаны для окон, попадающих в область [-75, 49] вокруг TSS.

Последовательность основного промотора также свидетельствует о максимальной активности промотора у человека

Наши результаты, приведенные выше, показывают, что основная последовательность промотора указывает на максимальную активность промотора у дрожжей. Возникает естественный вопрос, верны ли эти результаты и для других организмов.

Чтобы изучить это, мы изучили данные об экспрессии мРНК (37) 10 линий клеток человека (GM12878, GM12892, h2-hESC, HCT116, HeLa-S3, HepG2, HSMM, HUVEC, K562 и MCF7), доступных с разрешением TSS ( для каждого гена сообщается о количестве мРНК FPKM для различных TSS, см. также дополнительную информацию). Для каждой клеточной линии было проведено от двух до четырех повторов измерений экспрессии мРНК, и для каждого TSS мы консервативно приняли минимальное значение повтора в качестве его уровня экспрессии мРНК.Затем мы выбрали только TSS, которые экспрессировались во всех клеточных линиях и были наиболее высоко экспрессированы среди всех других TSS того же гена. Это оставило нас с набором из 8025 TSS, которые конститутивно экспрессируются в указанных выше 10 клеточных линиях (см. Дополнительную таблицу S2). Далее мы определили две подгруппы этих TSS на основе их максимальной экспрессии мРНК (максимальная FPKM по 10 различным клеточным линиям): 1035 TSS с высокой максимальной экспрессией мРНК (максимальная FPKM ≥ 100) и 1218 TSS с низкой максимальной экспрессией (максимальная FPKM). < 5).Подмножество с высокой максимальной экспрессией по определению представляет собой подмножество TSS с высокой максимальной промоторной активностью. Подмножество с низкой максимальной экспрессией является аппроксимацией подмножества с низкой максимальной активностью промотора, поскольку некоторые из его TSS могут быть высоко экспрессированы в других клеточных линиях или условиях, или, альтернативно, их продукты мРНК могут быть сильно подавлены посттранскрипционно.

Подобно нашему анализу на дрожжах (см. выше), мы проанализировали различные сигналы последовательности в области [-200, 100] вокруг TSS, включая содержание оснований (мононуклеотиды и G + C), содержание CpG и GpC, а также процент TSS с попаданиями TATA-бокса или с совпадениями 6-меров согласованного мотива фактора транскрипции SP1 (GGGCGG или его обратного дополнения CCGCCC).Для всех этих сигналов последовательности (рис. 7A) наблюдались значительные различия (см. ранговую сумму P -значения на дополнительном рисунке S4) между набором TSS с высокой максимальной экспрессией (рис. 7A, левый столбец) и набором TSS с низкой максимальной экспрессией (рис. 7А, средний столбец).

Рисунок 7.

Сигналы последовательностей основного промотора человека различаются между конститутивными TSS с различной максимальной экспрессией. ( A ) Среднее содержание нуклеотидов, k-меров и ТАТА-боксов, рассчитанное с использованием скользящего окна (длина 20 п.н., шаг 10 п.н.) по области [-200, 100] вокруг TSS, которые конститутивно экспрессируются в 10 различных клетках человека. линии ( 37 ).Графики расположены в трех столбцах: конститутивные TSS с высокой максимальной экспрессией слева, конститутивные TSS с низкой максимальной экспрессией в середине и все конститутивные TSS справа. Вертикальные пунктирные линии представляют расположение TSS. Горизонтальные пунктирные линии предназначены для облегчения сравнения графиков между столбцами. SP1 — 6-меры GGGCGG\CCGCCC консенсусного мотива связывания ТФ SP1. ( B ) Пятьдесят из вышеперечисленных конститутивных TSS были из RP, и они были разделены на две подгруппы: 25 с более высокой экспрессией и 25 с более низкой экспрессией (на основе их максимальной экспрессии). Среднее содержание нуклеотидов вокруг TSS показано для двух подмножеств.

Рисунок 7.

Сигналы последовательностей основного промотора человека различаются между конститутивными TSS с различной максимальной экспрессией. ( A ) Среднее содержание нуклеотидов, k-меров и ТАТА-боксов, рассчитанное с использованием скользящего окна (длина 20 п.н., шаг 10 п.н.) по области [-200, 100] вокруг TSS, которые конститутивно экспрессируются в 10 различных клетках человека. линии ( 37 ). Графики расположены в трех столбцах: конститутивные TSS с высокой максимальной экспрессией слева, конститутивные TSS с низкой максимальной экспрессией в середине и все конститутивные TSS справа.Вертикальные пунктирные линии представляют расположение TSS. Горизонтальные пунктирные линии предназначены для облегчения сравнения графиков между столбцами. SP1 — 6-меры GGGCGG\CCGCCC консенсусного мотива связывания ТФ SP1. ( B ) Пятьдесят из вышеперечисленных конститутивных TSS были из RP, и они были разделены на две подгруппы: 25 с более высокой экспрессией и 25 с более низкой экспрессией (на основе их максимальной экспрессии). Среднее содержание нуклеотидов вокруг TSS показано для двух подмножеств.

TSS с высокой максимальной экспрессией, как правило, имеют значительно более низкое содержание A и T вокруг TSS, чем TSS с низкой максимальной экспрессией (дополнительный рисунок S4A и дополнительные данные), и, наоборот, более высокое содержание C, G, G\C, GpC и CpG вокруг TSS (дополнительный рисунок S4C – G).Хотя известно, что основные промоторы человека имеют высокое содержание G\C, GpC и CpG по сравнению с фланкирующими областями (38, 39), здесь мы показываем, что содержание их основных промоторов свидетельствует о максимальной активности промотора. Соответственно, было обнаружено, что особенности богатства G\C, GpC и CpG вокруг TSS значительно различаются между TSS с высокой и низкой максимальной экспрессией с показателями AUC 0,623, 0,64 и 0,682 соответственно (дополнительная фигура S5). Недавно одно исследование показало, что высокое содержание G\C и CpG способствует истощению нуклеосом в промоторах млекопитающих, как in vivo , так и in vitro (40). Таким образом, более высокое содержание G\C и CpG вокруг TSS будет снижать его нуклеосомную занятость, делая его более доступным для образования PIC и, следовательно, более выраженным, в соответствии с нашими результатами. Важно отметить, что наше внимание здесь к конститутивным коровым промоторам устраняет возможность того, что различия между TSS с высокой и низкой максимальной экспрессией обусловлены различиями между конститутивными и тканеспецифичными коровыми промоторами (например, известно, что конститутивные человеческие коровые промоторы содержат больше CpG). ( 39 )).

Среди нескольких мотивов TF, которые, как известно, обогащены коровыми промоторами конститутивных генов, мотивы SP1 являются наиболее распространенными (38). Консенсусные 6-меры SP1 (GGGCGG или его обратный комплемент CCGCCC) в 100 п.н. выше TSS обнаружены в 3355 из 8025 (41,8%) конститутивных основных промоторов и значительно истощены в субпопуляции с низкой максимальной экспрессией (обнаруженной в 304 из 1218, 25%, P < 10 ^{— 39} ), предполагая, что их существование может способствовать более высоким уровням максимальной активности промотора. Другие мотивы TF, которые, как известно, обогащены основными промоторами, включают мотивы NF-Y (CAAT-box) и ETS (38). Подобно консенсусным 6-мерам SP1, как консенсусные 5-меры NF-Y (CCAAT или его обратный комплемент ATTGG), так и консенсусные 6-меры ETS (CCGGAA или его обратный комплемент TTCCGG) встречаются чаще вокруг TSS с высокой максимальной экспрессией, чем вокруг низкой максимальной экспрессии. выражение TSS (дополнительный рисунок S6).

В то время как 10–24% генов человека, по оценкам, имеют основной промотор, содержащий ТАТА-бокс, было показано, что основные промоторы конститутивно экспрессируемых генов человека в основном не содержат ТАТА (41).В соответствии с этим консенсусные ТАТА-боксы (TATAWAWR), расположенные на расстоянии 50–20 п.н. выше TSS, обнаружены только в 60 из 8025 конститутивных основных промоторов (0,75%). Несмотря на небольшое количество, они значительно обогащены подмножеством с высокой максимальной экспрессией (обнаружено у 29 из 1035, 2,8%, P < 10 ^{− 11} ) и истощены в подмножестве с низкой максимальной экспрессией (обнаружено у 3 из 1218, 0,25%, P — значение 0,013), что свидетельствует о том, что бокс ТАТА может способствовать более высоким уровням максимальной активности промотора, как у дрожжей (см. выше).

В то время как для большинства вышеперечисленных элементов последовательности средний сигнал TSS с высокой максимальной экспрессией (рис. 7A, левый столбец) кажется относительно похожим на сигнал всех конститутивных TSS (рис. 7A, правый столбец), существуют значительные различия. между двумя наборами (см. Дополнительный рисунок S4B-E). В частности, TSS с высокой максимальной экспрессией, как правило, имеют более высокое содержание C непосредственно перед TSS и более низкое содержание G в и после TSS по сравнению со средним конститутивным TSS.

Из определенного выше набора из 8025 конститутивных TSS 50 были TSS рибосомных белков (RP). RP человека имеют общую архитектуру основного промотора (42, 43), и большинство из них сходным образом экспрессируются в тканях (44), что позволяет предположить, что они регулируются совместно. Многие из 50 конститутивных TSS RP были очень высоко экспрессированы, причем 46 из них были включены в указанную выше подгруппу TSS с высокой максимальной экспрессией. Мы разделили эти 50 TSS на 25 с более высокой максимальной экспрессией и 25 с более низкой максимальной экспрессией и сравнили их среднее базовое содержание с TSS (рис. 7 B).Здесь мы также обнаружили существенные различия между двумя подмножествами. В частности, TSS RP с более высокой максимальной экспрессией, как правило, богаче C и беднее G в окне [-10, 9] вокруг TSS (сумма рангов P — значения 0,02 и 0,032 соответственно). Соответственно, содержание C в этом окне отделяет TSS RP с более высокой максимальной экспрессией от более низких с показателем AUC 0,69. Показано, что сердечные промоторы RP млекопитающих имеют полипиримидиновый инициатор (43). Наши результаты показывают, что содержание пиримидина в этом элементе-инициаторе может влиять на его эффективность.

Наконец, следуя той же схеме обучения 10-кратной линейной модели CV, что и для данных о дрожжах (см. выше), мы изучили 10 линейных моделей, которые предсказывают максимальную экспрессию (логарифм максимальной меры FPKM) 8025 конститутивных TSS человека из базовое содержание и особенности k-mer их основных промоторов. Средние показатели производительности модели ( R ² , корреляция Пирсона r , корреляция Спирмена ρ ) и таблица с подробным описанием 58 надежных функций (которые были включены как минимум в 9 из 10 моделей) показаны на дополнительном рисунке. С7.Линейные модели могли объяснить, в среднем, только 7% вариаций в максимальном выражении тестовых TSS с выдержкой (с соответствующими средними тестами r = 0,268 и ρ = 0,238), но неизменно так (низкое стандартное отклонение между моделями). Низкая предсказательная сила этих линейных моделей, вероятно, связана с большой сложностью и разнообразием архитектур промоторов ядра человека. В соответствии с приведенными выше результатами было обнаружено, что особенности CpG-содержащих k-меров являются наиболее значимыми предикторами более высокой максимальной экспрессии, а также было обнаружено, что особенности консенсусных k-меров TATA box, NF-Y, ETS и SP1 вносят вклад в высшее максимальное выражение.

В совокупности наши результаты показывают, что различные особенности последовательности основного промотора человека являются предикторами максимальной активности промотора, предполагая, что они, вероятно, играют причинную роль в их определении.

ОБСУЖДЕНИЕ

Возможные функциональные роли различных особенностей дрожжевого ядра

В этой работе мы изучили взаимосвязь между последовательностью основного промотора дрожжей и максимальной активностью промотора. Используя структуру линейного моделирования, мы смогли выделить краткий набор особенностей основного промотора дрожжей, которые могут играть роль в определении максимальной активности промотора, из большого исходного набора базовых элементов и признаков k-mer.

Большинство этих признаков расположены между 75 п.н. выше и 50 п.н. ниже основного TSS, в основном ниже сигналов связывания TBP (см. рис. 1). Следуя нашему анализу базового содержания, показанному на рисунке 1, мы распределили эти функции по 3 основным классам (рисунок 4): признаки T-богатых или T-бедных элементов выше по течению от основного TSS, характеристики элементов, связанных с TSS (в основном A-богатых) на и ниже по течению от основного TSS и особенности элементов, богатых G\C, вокруг основного TSS.

Мы показали, что основные промоторы, обладающие высокой максимальной промоторной активностью, как правило, богаты T выше основного TSS и богаты A в месте и ниже основного TSS (рис. 1, 3 и 4), и, кроме того, это верно для как конститутивные, так и регулируемые гены (рис. 1 и 3).Это говорит о том, что T-обогащение, за которым следуют сигналы A-обогащения, не влияет на регуляцию рекрутирования PIC (которая различается между конститутивными и регулируемыми генами), и поскольку они физически расположены ниже места образования PIC, они, вероятно, представляют собой сигналы, влияющие на сканирование pol-II и выделение TSS. Это согласуется с прошлыми данными о том, что pol-II подвергается дополнительным шагам, ограничивающим скорость, после его рекрутирования (45).

Высокая максимальная промоторная активность Ядерные промоторы также, как правило, имеют более низкое содержание G\C вокруг своей основной TSS (рис. 1).Опять же, это верно как для конститутивных, так и для регулируемых генов, хотя они различаются по своему общему ландшафту содержания G\C, указывая на то, что и здесь эффект оказывается на сканирование pol-II и отбор TSS. Поскольку содержание G\C и собственная занятость нуклеосомы сильно коррелированы ((33), рис. 1 и 2А), это позволяет предположить, что более низкая собственная занятость +1 нуклеосомы (рис. 2А) по сравнению с TSS способствует более высокой максимальной активности промотора. .

Два основных различия между основными промоторами конститутивных и регулируемых генов очевидны (рис. 2).Во-первых, конститутивные промоторы ядра кодируют внутреннюю свободную от нуклеосом область (NFR) выше их основной TSS, в то время как большинство регулируемых промоторов ядра кодируют внутреннюю NFR в основной TSS. Во-вторых, занятость нуклеосом in vivo в условиях роста на богатой среде и внутренняя занятость конститутивных ядерных промоторов очень сходны, в то время как для многих регулируемых основных промоторов (особенно со средними и высокими E _max ) они не совпадают. , с их in vivo NFR, расположенными выше по течению от TSS.Недавно одно исследование показало, что в дрожжевых клетках, выращенных в богатой среде, TSS генов «TATA-less» (большинство из которых являются конститутивными генами) плотно расположены вокруг 5′-края +1 нуклеосомы, в то время как TSS «TATA-less» содержащие гены (большинство из которых являются регулируемыми генами) более свободно распределяются вниз по течению в +1 нуклеосомное положение (3). Это исследование показало, что в основных промоторах «ТАТА-содержащих» генов может существовать конкуренция между PIC и нуклеосомой +1, где образование PIC сочетается с выселением нуклеосомы +1, что устраняет препятствие для сканирования pol-II.Эта гипотеза была бы более адекватной, если бы +1 нуклеосомная занятость TSS была внутренней (что часто не так, как показано на рис. 2). Вместо этого мы предлагаем следующее объяснение. Во многих регулируемых генах репрессия или подавление достигается за счет ремоделирования нуклеосомы +1, смещения ее из ее изначально предпочтительного положения, ниже по течению от TSS, в более верхнее положение, где занята TSS. Этот способ репрессии был недавно продемонстрирован для генов, которые либо репрессируются при углеродном голодании, либо репрессируются в богатой среде (и индуцируются при углеродном голодании) (46).Сдвиг нуклеосомы +1 от ее изначально предпочтительного положения является временным (47), все еще позволяя рекрутировать PIC с более низкими скоростями, когда нуклеосома +1 смещается обратно в свое изначально предпочтительное положение, в котором TSS не занят. Такое ремоделирование не происходит в конститутивных генах, и, таким образом, их in vivo нуклеосомное размещение вокруг TSS очень сходно с внутренним. При такой модели репрессии за счет ремоделирования +1 нуклеосомы +1 нуклеосома не вытесняется, и как в конститутивных, так и в регулируемых генах PIC рекрутируется на коровый промотор, когда +1 нуклеосома находится в своем внутренне предпочтительном положении.Следовательно, как для конститутивных, так и для регулируемых генов можно ожидать, что более низкая внутренняя занятость нуклеосомами по сравнению с TSS приведет к меньшему количеству препятствий для сканирования pol-II и будет способствовать более высокой максимальной активности промотора. Это соответствует тому, что мы наблюдали.

Является ли T-обогащенность дрожжевого ядра, за которой следует A-обогащенность, сигналом локатора TSS?

Как упоминалось выше, (27) предположили, что T-обогащенность дрожжевого ядра, за которой следует A-обогащенность, является сигналом, который играет роль в локализации TSS, и назвали его «локатором» TSS. Поскольку большинство генов имеют несколько альтернативных TSS (различной интенсивности, см., например, (12)), это предполагает, что более сильный «локаторный» сигнал приведет к сфокусированной инициации транскрипции при одном сильном TSS, в то время как слабый «локаторный» сигнал приведет к в сторону дисперсной инициации транскрипции при множественных слабых TSS. Чтобы оценить это, мы использовали данные (48), которые измеряли несколько экземпляров TSS на ген (некоторые случаи представляли собой разные измерения одного и того же TSS) для многих из генов S. cerevisiae .Каждый измеренный экземпляр TSS фактически является образцом из неизвестного распределения TSS соответствующего гена, и количество образцов зависело от уровня экспрессии гена в клетках, выращенных в условиях богатой среды. Поэтому мы ограничили наш анализ сравнением конститутивных генов либо с высокой, либо с очень высокой максимальной промоторной активностью (как определено выше), поскольку они сильно экспрессируются в богатой среде. Тем не менее, чтобы избежать случаев со значительной недостаточностью выборки, мы использовали только гены, у которых было не менее 10 измеренных случаев TSS.Это оставило нам 31 (из 36) конститутивно-высоких генов и 77 (из 122) конститутивно-высоких генов. Для каждого гена мы рассчитали долю экземпляров TSS, которые находились в пределах 20 п.н. от основного TSS (того, у которого больше всего экземпляров), что указывает на то, насколько сфокусирована инициация транскрипции этого гена. На рисунке 8 мы показываем гистограммы этих значений для конститутивных-очень высоких и для конститутивно-высоких генов. Очевидно, что инициация транскрипции конститутивно-высоких генов имеет тенденцию быть более целенаправленной, чем конститутивно-высокие гены (ранговая сумма P -значение 0.0077). Это обеспечивает некоторую поддержку вышеупомянутой гипотезы «локатора» TSS, поскольку T-обогащенность, за которой следует сигнал A-обогащенности, сильнее в конститутивных очень высоких генах (рис. 1).

Рисунок 8.

Инициация транскрипции в конститутивных генах с высокой экспрессией более локализована, чем в конститутивных генах с более низкой экспрессией. Гистограммы меры, показывающей, насколько сфокусирована (менее рассредоточена) инициация транскрипции гена (доля экземпляров TSS, находящихся в пределах 20 п.н. от основного TSS, по данным (48)).Этот показатель был рассчитан для конститутивно-очень высоких и для конститутивно-высоких генов, у которых было измерено не менее 10 случаев TSS, и было обнаружено, что он значительно выше для конститутивно-очень высоких генов (ранговая сумма P — значение 0,0077).

Рисунок 8.

Инициация транскрипции в конститутивных генах с высокой экспрессией более локализована, чем в конститутивных генах с более низкой экспрессией. Гистограммы меры, показывающей, насколько сфокусирована (менее рассредоточена) инициация транскрипции гена (доля экземпляров TSS, находящихся в пределах 20 п.н. от основного TSS, по данным (48)). Этот показатель был рассчитан для конститутивно-очень высоких и для конститутивно-высоких генов, у которых было измерено не менее 10 случаев TSS, и было обнаружено, что он значительно выше для конститутивно-очень высоких генов (ранговая сумма P — значение 0,0077).

В этом исследовании мы показываем, что последовательность сердцевинного промотора предсказывает максимальную активность промотора, и предлагаем различные особенности последовательности, которые играют роль в ее определении как у дрожжей, так и у человека. Наши результаты также освещают открытые вопросы о том, как последовательность основного промотора влияет на активность промотора.В дрожжах мы еще не знаем, как основная последовательность промотора определяет распределение TSS и как это распределение TSS влияет на активность промотора. У человека мы до сих пор не знаем связи между множеством возможных конфигураций основных промоторных элементов и активностью промотора. Мы намерены исследовать эти вопросы в будущих исследованиях.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Европейский исследовательский совет (ERC) и Национальные институты здравоохранения США (NIH) (к E.S.). Э.С. является заведующим кафедрой развития карьеры Соретты и Генри Шапиро.Финансирование платы за открытый доступ: ERC; НИЗ США.

Заявление о конфликте интересов . Ни один не заявил.

ССЫЛКИ