Свойства мембраны: Свойства мембраны

3.1. Роль калиевых каналов

Чтобы определить, требуется ли клеткам S49 активированный кальцием поток калия для высвобождения микрочастиц, аналогичный тромбоцитам и эритроцитам, эксперимент, показанный на фиг. 2, был повторен в присутствии пониженного градиента калия.Кроме того, эксперимент был повторен с нормальной концентрацией калия в присутствии блокатора кальциевых каналов хинина [14–16]. Рисунок 3 показывает, что оба вмешательства привели к снижению количества микрочастиц, выделяемых из клеток, примерно на 80%. Эти результаты показали, что ток калия, активированного кальцием, был необходимым компонентом высвобождения частиц. Предположительно, этот ток необходим для осмотического уменьшения объема клетки, чтобы приспособиться к уменьшенной площади поверхности мембраны, связанной с отрывом микрочастиц [33, 34].

3.2. Потеря мембранной липидной асимметрии

Предыдущие генетические данные и эксперименты с фармакологическим ингибитором скрамблазы (R5421, [35]) продемонстрировали на эритроцитах и ​​тромбоцитах, что активность этого фермента важна для выделения микрочастиц [19, 29, 36]. Поскольку ингибитор скрамблазы больше не доступен, потребность в миграции PS от внутреннего к внешнему листку клеточной мембраны была протестирована здесь для клеток лимфомы с использованием линии лимфомы Raji, которая недостаточна по активности скрамблазы [37-40] .Белая полоса на фиг. 3 показывает ответ на иономицин в клетках Raji. Стимулированное иономицином изменение интенсивности светорассеяния в клетках Raji составляло только 16% от наблюдаемого в клетках S49. Более того, инкубация клеток Raji с более высокой дозой иономицина, достаточной для восстановления некоторой способности клеток перемещать PS [40], приводила к двукратному увеличению кажущейся скорости высвобождения микрочастиц (,,). Эти данные доказывают, что воздействие PS также важно для высвобождения микрочастиц в ядросодержащих клетках.

3.3. Membrane Lipid Order

Недавние исследования показали роль порядка и текучести мембранных липидов в определении способности эритроцитов высвобождать микровезикулы в ответ на кальций [29]. Чтобы изучить эту возможность для клеток S49, были проведены эксперименты при различных температурах от 32 до 42 ° C. Как показано на рисунке 4 (а), скорость высвобождения микрочастиц монотонно возрастает с температурой. Линейный регрессионный анализ показал, что эта тенденция была статистически значимой (см. Легенду).Контрольные эксперименты по оценке других известных эффектов иономицина (нарушение цитоскелета, чувствительность к фосфолипазе) продемонстрировали, что препарат был одинаково эффективен во всем этом температурном диапазоне (не показан). Следовательно, влияние температуры, по-видимому, было скорее на процесс высвобождения, чем на эффективность лекарства.

Относительный уровень порядка мембран также оценивали при этих температурах с помощью флуоресцентной спектроскопии с использованием анизотропии патмана GP и TMA-DPH. Данные с обоими зондами (Рисунки 4 (b) и 4 (c)) показали значительное уменьшение видимого порядка мембран.Соответственно, наблюдалась сильная корреляция между уровнем порядка, обнаруживаемым этими зондами, и скоростью высвобождения везикул (,, температуры, по линейной регрессии, значения применимы как к GP Патмана, так и к анизотропии TMA-DPH). В целом, рисунок 4 поддерживает гипотезу о том, что физические свойства мембран играют роль в высвобождении микрочастиц как для ядерных, так и для неядерных клеток.

4. Обсуждение

Похоже, что основные механизмы, управляющие выделением микрочастиц в тромбоцитах и ​​эритроцитах, могут широко применяться ко всем типам клеток.Это открытие означает, что высвобождение микрочастиц может быть просто следствием снижения стабильности клеточной мембраны. Следовательно, факторы, регулирующие процесс высвобождения, имеют биофизическую природу и представляют собой изъятие элементов, которые обычно поддерживают стабильность. Основываясь на этом исследовании и исследованиях, посвященных тромбоцитам и эритроцитам, эти критические элементы включают осмотический баланс клеток, прикрепления цитоскелета, асимметричное распределение фосфолипидов по двум сторонам мембраны и эластичные свойства бислоя [14–27, 29 , 41, 42].

Важность осмотического баланса очевидна из-за сопутствующего воздействия на объем клеток. Для компенсации потери площади поверхности плазматической мембраны по мере высвобождения микрочастиц потребуется уменьшение объема клетки. Более того, изменение объема предположительно будет способствовать отрастанию мембран из-за стресса, вызванного несоответствием площади поверхности. В случае высвобождения частиц, вызванного кальцием, уменьшение объема, по-видимому, связано с оттоком калия.

Как показано на Рисунке 1, изменения в актиновом цитоскелете сопровождают приток кальция, как и ожидалось [21-27].Попытки проверить важность этого события посредством фармакологического ингибирования изменений цитоскелета (например, ингибирования кальпаина) не увенчались успехом, вероятно, из-за дублирующих механизмов действия кальция [3]. В эритроцитах и ​​тромбоцитах, где механизмы регуляции проще, ингибирования кальпаина достаточно, чтобы нарушить высвобождение микрочастиц [15, 22, 23, 28]. В той степени, в которой эти находки широко применимы ко всем типам клеток [24-27], они подразумевают, что одна важная роль ассоциированного с мембраной цитоскелета состоит в поддержании стабильности и предотвращении высвобождения частиц.

Роль трансбислойной асимметрии видов фосфолипидов в поддержании стабильности мембран кажется менее очевидной. Потеря этой асимметрии во время внутреннего накопления кальция приводит к обнажению ФС на внешней поверхности. Этому воздействию уделялось много внимания из-за роли PS как сигнального механизма в гемостазе и распознавании апоптотических клеток макрофагами [43]. Почему внешнее воздействие этого липида допустимо для высвобождения пузырьков, неясно. Фактически, может оказаться, что на самом деле критической проблемой является снижение PS внутри мембраны.Поскольку некоторые белки с C2-подобными доменами участвуют в закреплении цитоскелета и мембраны [44], снижение PS на поверхности внутриклеточной мембраны может приводить к потере критических взаимодействий белков, что приводит к снижению стабильности мембраны. Это объяснение могло бы объяснить, почему движение такого второстепенного компонента может иметь такое большое влияние на мембрану. Более того, возможно, что PS не является решающим или единственным участником в разрешении высвобождения микрочастиц, поскольку нагрузка кальцием также будет приводить к внешнему воздействию фосфатидилэтаноламина и внутриклеточному накоплению фосфатидилхолина через ингибирование транслоказы аминофосфолипидов и активацию скрамблазы [3].

Роль порядка мембран отличается от роли калиевого тока, разрушения цитоскелета и активации скрамблазы. Кажется, что каждый из последних трех необходим, хотя по отдельности недостаточен для высвобождения микрочастиц. Напротив, порядок мембран, по крайней мере, на уровне, доступном для экспериментальных манипуляций в живых клетках, функционировал только как модулятор скорости высвобождения. Только минимальная тенденция в видимом количестве выделяемых мембранных частиц наблюдалась во всем диапазоне температур, что позволяет предположить, что существует предел того, сколько выделяется или может быть высвобождено (по линейной регрессии, –15 на температуру, 83 балла).

Кажется вероятным, что вклад порядка мембраны связан с эластичностью мембраны. Предположительно, снижение эластичности при повышении температуры создает гибкость мембраны, допускающую деформацию, достаточную для прорастания и высвобождения микрочастиц [41, 42]. Кажущаяся верхняя граница количества выделяемых частиц может определяться величиной осмотически индуцированного изменения объема и / или степенью цитоскелетного изменения. Предел может быть ключевым для выживания клеток, поскольку не все события, приводящие к отщеплению микрочастиц, связаны с гибелью клеток [3].

5. Выводы

Результаты этого исследования демонстрируют, что биофизические механизмы, участвующие в высвобождении микрочастиц в эритроцитах и ​​тромбоцитах, вероятно, широко применимы ко всем типам клеток. К ним относятся отток ионов калия (предположительно с сопутствующими осмотическими эффектами), потеря асимметрии мембранных фосфолипидов и нарушение цитоскелета. Более того, уровень липидного порядка мембраны, по-видимому, модулирует процесс высвобождения, при этом более высокие скорости высвобождения происходят из более жидкой мембраны.Этот очевидный эффект порядка мембран предполагает, что условия, в которых эти физические свойства изменяются, могут способствовать усиленному или несоответствующему отрыву микрочастиц. Очевидный пример — во время апоптоза, когда клеточная мембрана становится неупорядоченной и более жидкой до образования пузырей на мембране и отрыва микрочастиц [45]. В качестве второго примера недавние исследования уровней микрочастиц в крови глубоководных дайверов показали, что частицы поднимаются вверх после декомпрессии после погружения [46].Это снижение давления, несомненно, повлияет на физические свойства клеточной мембраны, аналогично повышению температуры на Рисунке 4. Кроме того, в нескольких отчетах указывалось, что плазматическая мембрана некоторых опухолевых клеток более неупорядочена, чем у соответствующих нетрансформированных. клетки [47–50]. Это повышает вероятность того, что частицы, выделяемые этими клетками в большем количестве, могут распространять сигналы от опухоли, которые могут повлиять на патогенез заболевания.

Конфликт интересов

Конфликт интересов относительно публикации данной статьи отсутствует.

Взаимосвязь между твином и свойствами мембраны и устойчивостью к высокому давлению Lactobacillus plantarum | BMC Microbiology

Бактерии и условия культивирования

Lactobacillus plantarum Штамм TMW 1.708 хранился при -80 ° C в смеси 1: 1 80% глицерина и модифицированной среды MRS (mMRS) (10 г L ^{— 1} пептон из казеина, 5 г L ^{— 1} мясной экстракт, 5 г L ^{— 1} дрожжевой экстракт, 4 г L ^{— 1} KH ₂ PO ₄ , 2.6 г л ^-1 K ₂ HPO ₄ * 3 H ₂ O, 3 г л ^-1 NH ₄ Cl, 0,5 г л ^-1 цистеин-HCl, 1 г л ^-1 Твин 80, 7,5 г л ^-1 глюкоза, 7,5 г л ^-1 фруктоза, 0,1 г л ^-1 MgSO ₄ * 7 H ₂ O, 0,05 г л ^-1 MnSO ₄ * 4 H ₂ O, pH 6,2) [22]. Глюкозу и фруктозу автоклавировали отдельно. Исходный раствор 1000 × MgSO ₄ * 7 H ₂ O и MnSO ₄ * 4 H ₂ O стерилизовали фильтрованием (0.Размер пор 2 мкм, Зарштедт, Нюрнбрехт, Германия). Оба раствора добавляли в среду после автоклавирования. Для активации штамма полную петлю криокультуры переносили в среду mMRS, из которой исключили Tween 80 (mMRS-). Культуру инкубировали при 30 ° C в течение ночи. Ночная культура использовалась в качестве инокулята в экспериментах.

Среда mMRS, содержащая разные типы твинов

Lactobacillus plantarum выращивалась либо в mMRS-, либо в mMRS, содержащей 1 г L ^-1 Tween 20 (mMRST20), Tween 40 (mMRST40), Tween 60 (mMRST60) или Tween 80 (мМРСТ80).Все типы твинов были приобретены в компании Merck (Дармштадт, Германия). Различные типы Твина солюбилизировали в mMRS- в концентрации 10 г L ^-1 , стерилизовали фильтрованием (размер пор 0,2 мкм, Sarstedt, Nürnbrecht, Германия) и, наконец, добавляли к mMRS-, чтобы получить концентрацию 1 г. Л ^{— 1} .

Среда mMRS, содержащая свободные жирные кислоты

Свободные жирные кислоты, т.е. стеариновая кислота (Merck Schuchard, Hohenbrunn, Германия), олеиновая кислота (Merck Darmstadt, Германия), линолевая кислота (Sigma, Steinheim, Германия), линоленовая кислота (Sigma, Steinheim, Германия), пальмитиновая кислота (Merck Schuchard, Hohenbrunn, Германия), пальмитолеиновая кислота (Fluka Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), миристиновая кислота (Merck Schuchard, Hohenbrunn, Германия) или лауриновая кислота (Merck, Дармштадт, США). Германия) солюбилизировали в 95% этаноле до концентрации 50 мМ.Любой из этих исходных растворов добавляли 1: 1000 к mMRS-, чтобы получить конечную концентрацию жирных кислот 50 мкМ.

Транскриптомный анализ

Чтобы исследовать влияние Твина 80 на метаболизм L. plantarum TMW 1.708, оценивали транскриптомный ответ на добавление в среду твина 80. Для этого стерильный mMRS- инокулировали (1% ( v / v)) ночной культурой TMW 1.708 и инкубировали при 30 ° C в течение 24 часов. Еще 9 мл mMRS- инокулировали 1% (об. / Об.) Этой 24-часовой культуры и выращивали при 30 ° C в течение 4 часов с последующим добавлением 1 мл mMRS- или mMRS, содержащих 10 г L ^-1. Твин 80.Транскрипцию останавливали через 0,5 ч инкубации при 30 ° C добавлением к культуре реагента RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen, Hilden, Германия). После этого мРНК выделяли и очищали с использованием мини-набора RNeasy (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Конечную концентрацию РНК определяли с помощью спектрометрии поглощения света с использованием устройства NanoDrop ™ (Wilmington, DE, USA). Затем образцы отправляли в GATC Biotech (Констанс, Германия) для секвенирования РНК. Данные секвенирования анализировали с помощью программы Rockhopper на основе генома L.plantarum TMW 1.708 (биопробы: SAMN05805046 [23]) [24, 25]. Считалось, что гены с скорректированными значениями p ниже 0,05 демонстрируют значительно разные уровни экспрессии. Квантили 2,5% с наибольшим увеличением и снижением уровня экспрессии рассматривались для дальнейшего исследования.

Исследование параметров роста

Чтобы оценить влияние Твина 80 на характерные параметры роста L. plantarum TMW 1.708, были записаны кривые роста с помощью измерения OD ₆₀₀ .В дополнение к Tween 80, в исследование были включены три дополнительных типа Tween, а именно Tween 20, Tween 40 и Tween 60, которые характеризуются лауриновой кислотой, пальмитиновой кислотой и стеариновой кислотой в качестве их специфической жирной кислоты соответственно. Для этого mMRS-, mMRST20, mMRST40, mMRST60 и mMRST80 инокулировали (1% ( v / v)) 24-часовой культурой TMW 1,708 в mMRS-. Затем аликвоту каждой инокулированной среды (150 мкл на лунку) переносили в 96-луночный планшет (стерильный, прозрачный, F-дно, Sarstedt, Nürnbrecht, Германия).Каждую лунку покрывали 50 мкл стерильного парафинового масла, чтобы избежать испарения. Планшет инкубировали при 30 ° C в планшет-ридере FLUOStar Omega (BMG Labtech, Ортенберг, Германия) в течение 30 часов. Оптическую плотность при 600 нм (OD ₆₀₀ ) измеряли каждые 30 мин после перемешивания при 200 об / мин в течение 30 с.

Определение состава мембранных жирных кислот

Для определения профилей клеточных жирных кислот стерильный mMRS- инокулировали 1% ( v / v) ночной культуры TMW 1.708 и инкубировали при 30 ° C в течение 24 часов. Свежий mMRS- или mMRST20 / 40/60/80 инокулировали (1% (об. / Об.)) 24-часовой культурой и инкубировали при 30 ° C в течение еще 24 часов, чтобы получить плотность клеток приблизительно 10 ⁹ образующих колонию ед. (КОЕ) мл ^{— 1} . Клетки собирали центрифугированием (5000 × g, 25 ° C, 5 мин), трижды промывали раствором Рингера-крепости и, наконец, сушили вымораживанием с использованием системы сублимационной сушки FreeZone Plus 2,5 л (Labonco, Канзас-Сити, Миссури, США. ). Лиофилизат хранили в атмосфере N ₂ .Анализы жирных кислот были выполнены Службой идентификации DSMZ (Брауншвейг, Германия).

Обработка HHP

Для обработок HHP клетки, выращенные в соответствующей среде при 30 ° C в течение 24 ч, центрифугировали (5.000 × g, 25 ° C, 5 мин), промывали один раз в имидазол / фосфатном буфере (IPB, 0,1 г L ^-1 KH ₂ PO ₄ , 4,45 г L ^-1 NA ₂ HPO ₄ * 2 H ₂ O, 1,7 г L ^-1 имидазол, pH 7,0) и , наконец, ресуспендировали в IPB, чтобы получить 10 ⁷ –10 ⁸ КОЕ мл ^{— 1} для экспериментов по инактивации и 10 ⁸ –10 ⁹ КОЕ мл ^{— 1} для экспериментов, исследующих метаболическую активность, белок высвобождение и проницаемость мембраны для обеспечения достаточной силы сигнала во время измерений.Аликвоту 600 мкл клеточной суспензии переносили в криохвосты (флаконы Nunc CryoTube ™ емкостью 0,5 мл, внутренняя резьба, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Были приняты меры, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха. Образцы находились под давлением в двух параллельно соединенных емкостях под давлением объемом 7 мл, снабженных термостатирующими рубашками (установка высокого давления TMW-RB, описанная ранее [26, 27]). В качестве жидкости, передающей давление, использовали смесь 70% полиэтиленгликоля 400 (Roth, Карлсруэ, Германия) и 30% деионизированной воды.Температуру сосуда поддерживали постоянной на уровне 25 ° C (FC 600; JULABO, Зельбах, Германия). Перед началом линейного изменения давления образцы инкубировали в течение 5 минут в сосуде высокого давления для достижения желаемой начальной температуры. Скорость сжатия и декомпрессии поддерживалась постоянной и составляла 200 МПа мин. ^{— 1} . Комбинации целевого давления / времени выдержки были выбраны с учетом их способности инактивировать значительную часть клеток L. plantarum в популяции и указаны индивидуально для каждого эксперимента в разделе результатов.

Влияние HHP на жизнеспособность клеток

Контрольные образцы под давлением и без давления разбавляли изотоническим раствором триптона с добавлением Antifoam B (145 мМ NaCl, 14 г L ^{— 1} триптон, 0,01% ( v / v) Antifoam B Эмульсия). Серийные разведения наносили на чашки с mMRS с добавлением 15 г агара L ^-1 с использованием стеклянных шариков. Для определения сублетального повреждения в агар добавляли 7% NaCl ( w / против ), а максимальная неингибирующая концентрация, согласно литературным данным [28], была определена для L.plantarum TMW 1.708 в отдельном эксперименте (данные не показаны). Планшеты инкубировали в течение 72 часов при 30 ° C для восстановления клеток и образования колоний. Эксперименты по инактивации под высоким давлением проводили, по крайней мере, в трех независимых повторах.

Влияние HHP на метаболическую активность

Для определения метаболической активности после обработки HHP готовили исходный раствор (70 мМ) соли резазурин-Na (Serva, Heidelberg, Германия) в IPB, разбавленный до 1 мкМ в IPB, содержащем 15 г L ^-1 глюкозы и 15 г L ^-1 фруктозы, стерилизованные на фильтре (0.2 мкм, Sarstedt, Nürnbrecht, Germany), давая использованный рабочий раствор резазурина. Для измерения метаболической активности 100 мкл рабочего раствора резазурина смешивали с 100 мкл обработанной давлением или необработанной клеточной суспензии на белых 96-луночных микротитрационных планшетах (F-bottom, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и определяли интенсивность флуоресценции. (ex / em: 544/590 нм) измеряли во время инкубации при 30 ° C на считывающем устройстве для микропланшетов Omega FLUOStar (BMG Labtech, Ортенберг, Германия) каждые 120 с в течение 30 мин.Анализ основан на том факте, что синий краситель резазурин восстанавливается клеточными ферментами до красного флуоресцентного резоруфина. Реакция протекает быстрее, чем больше метаболически активных клеток присутствует в образце, поэтому метаболическую активность можно определить по наклону увеличения флуоресценции. Увеличение интенсивности флуоресценции с течением времени, выраженное в процентах от количества необработанных клеток, использовали для оценки индуцированных HHP изменений метаболической активности клеток L. plantarum .

Влияние HHP на высвобождение белка

Для определения высвобождения белка при обработке под высоким давлением использовали аликвоту 500 мкл обработанного давлением образца (10 ⁸ –10 ⁹ КОЕ мл ^{— 1} ). переносили в стерильную реакционную пробирку и центрифугировали (2800 × g, 5 ° C, 15 мин). Супернатант стерилизовали фильтрованием (размер пор 0,2 мкм, Sarstedt, Nürnbrecht, Германия), и концентрацию белка измеряли на черных 96-луночных микротитровальных планшетах (F-дно, Greiner bio-one, Frickenhausen, Германия) с использованием Pierce ™ Набор для анализа Coomassie Plus (Bradford) (ThermoFisher, Waltham, MA, USA) в соответствии с протоколом микро MTP, предоставленным производителем.Образцы инкубировали при 25 ° C в темноте в течение 10 минут и оптическую плотность при 595 нм измеряли в планшет-ридере FLUOStar Omega (BMG LABTECH GmbH, Ортенберг, Германия). Бычий сывороточный альбумин, входящий в комплект, использовали для построения стандартной кривой для концентраций белка от 0 до 25 мкг / мл ^-1 .

Влияние HHP на проницаемость мембраны

Проницаемость мембраны определяли с использованием флуоресценции пропидия иодида (PI), как описано ранее [29]. Для определения временной проницаемости мембраны суспензии клеток (10 ⁸ –10 ⁹ КОЕ мл ^{— 1} ) в IPB смешивали с PI (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) до конечной концентрации. 3 мкМ перед обработкой HHP.После сброса давления образцы дважды промывали IPB (10000 × g, 5 мин, 25 ° C) и, наконец, ресуспендировали в двойном исходном объеме IPB. Постоянную проницаемость мембраны определяли окрашиванием PI сразу после обработки HHP с последующей инкубацией в течение не менее 15 минут в темноте и последующей очисткой, как описано выше. Суспензии необработанных и инактивированных нагреванием (100 ° C, 15 мин) клеток смешивали с PI параллельно с образцами, обработанными давлением, и использовали в качестве отрицательного и положительного контроля, представляя популяции без повреждения мембраны и, следовательно, с минимальной интенсивностью флуоресценции или с полностью разрушенные мембраны, приводящие к максимально достижимому сигналу флуоресценции соответственно.Проницаемость мембраны определяли путем измерения интенсивности флуоресценции (возбуждение / испускание: 485/620 нм) на черных 96-луночных планшетах (F-bottom, Greiner bio-one, Frickenhausen, Германия) с использованием считывающего устройства для микропланшетов FLUOStar Omega (BMG Labtech). , Ортенберг, Германия). В целях нормализации OD ₆₀₀ измеряли параллельно (U-образное дно, нестерильно, Sarstedt, Nürnbrecht, Германия). Для микроскопического анализа образцы обрабатывали, как описано выше, за исключением того, что окрашивание проводили с использованием набора LIVE / DEAD BacLight Bacterial Viability (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), содержащего SYTO®9 и PI.Конечная концентрация каждого красителя в образце составляла 3 мкМ. Аликвоту 5 мкл окрашенного образца наносили на предметное стекло микроскопа (Roth, Карлсруэ, Германия), накрывали покровным стеклом и исследовали под микроскопом Axiostar plus (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Йена, Германия), оборудованным эпифлуоресцентным устройством. Окрашенные клетки визуализировали с использованием эпифлуоресцентного света с соответствующими фильтрами (SYTO®9: Excitation BP 475/40, Emission BP 530/50; иодид пропидия: Excitation BP 546/12, Emission LP 590).Во всех случаях использовался 100-кратный объектив, что давало общее увеличение в 1000 раз. Изображения были получены с помощью камеры RGB с разрешением 1,388 × 1,038 пикселей (AxioCam ICc1) и обработаны с помощью программного обеспечения AxioVS40 V 4.8.2.0 (Carl Zeiss MicroImaging, Йена, Германия).

Анализ данных

Для определения значимости различий между измеренными значениями использовался t-критерий Стьюдента для сравнения двух значений и дисперсионный анализ (ANOVA) для сравнения большего количества значений. Если значения ANOVA были значительными, за анализом ANOVA следовали апостериорный тест Стьюдента-Ньюмана-Кеулса для парного сравнения.Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения Sigmaplot. Результаты считались значимыми, когда значения p были <0,05.

Нелинейные свойства мембраны в звездчатых клетках энторинального кортикального слоя уменьшают модуляцию реакции ввода-вывода колебаниями напряжения

Цитирование: Fernandez FR, Malerba P, White JA (2015) Нелинейные свойства мембраны в звездчатых клетках энторинального кортикального слоя уменьшаются Модуляция откликов ввода-вывода колебаниями напряжения.PLoS Comput Biol 11 (4): e1004188. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004188

Редактор: Альдо А. Фейсал, Имперский колледж Лондона, СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО

Поступила: 26 июня 2014 г .; Одобрена: 10 февраля 2015 г .; Опубликован: 24 апреля 2015 г.

Авторские права: © 2015 Fernandez et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все данные, лежащие в основе выводов рукописи доступен по этой ссылке Dropbox: https: // www.dropbox.com/sh/sqf3cmnqj9f9jk2/AAAp-RrMe_OFgOtrXGTuF1Hka?dl=0

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (R01MH085074 (JAW)). Финансирующие агентства не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Напряжение мембраны в корковых нейронах определяется флуктуациями, опосредованными случайной синаптической активностью [1–4].Поскольку вероятностные переходы через пороговые значения, связанные с колебаниями, снижают порог спайков, обеспечивая спайковую реакцию на подпороговые входные сигналы [5,6], была выдвинута гипотеза, что фоновая активность усиливает чувствительность нейронов и тем самым позволяет флуктуациям изменять функции ввода-вывода. нейронов [7–12]. В соответствии с этой гипотезой, записи in vivo часто показывают большие различия в интервалах между спайками [13,14]. Спектральные свойства колебаний напряжения также коррелируют с различными когнитивными состояниями, подтверждая идею о том, что флуктуации играют важную роль в модуляции выброса импульсов [4,15-17].Наконец, вычислительные модели предполагают, что нейроны чувствительны к переходным входам и модулируют свою функцию вход-выход в ответ на изменения размера флуктуаций мембранного напряжения [10,18–20].

Однако по двум причинам неясно, справедливы ли в целом результаты сильного воздействия флуктуаций мембранного потенциала на отношения ввода-вывода. Во-первых, данные, подтверждающие сильную взаимосвязь, поступают только от нескольких типов нейронов [8,11,21–23]. Во-вторых, даже эти ограниченные исследования показали значительные различия в величине эффекта [21,23–25].Эти наблюдения указывают на возможную сложную взаимосвязь между флуктуациями мембранного напряжения и модуляцией ввода-вывода нейронов. Модуляция ответов ввода-вывода, вероятно, зависит от множества факторов, включая подпороговые свойства, зависящие от напряжения, присутствующие в нейронах. Например, отрицательная наклонная проводимость, связанная с током Na ⁺ , который увеличивает сопротивление мембраны в непосредственной близости от порога спайков [26], как было показано, снижает чувствительность нейронов к высокочастотным колебаниям напряжения в модельных нейронах [27].

Чтобы изучить, как нелинейные свойства мембраны определяют степень модуляции входных-выходных ответов в нейронах на основе флуктуаций, мы записали данные со звездчатых клеток MEC. Эти нейроны проявляют сильные нелинейные мембранные свойства при подпороговых напряжениях и характеризуются зависимым от напряжения изменением сопротивления мембраны [28–30]. Подобно другим кортикальным нейронам, in vivo записи звездчатых клеток установили наличие больших флуктуаций мембранного напряжения, которые могут влиять на реакции ввода-вывода [31,32].

Используя стандартные измерения выходного сигнала пиков в виде кривых частота-ток и вероятность пиков, а также анализ генерации пиков в модели экспоненциальной утечки, интеграции и возгорания, мы исследовали биофизические факторы, регулирующие способность к колебаниям напряжения. модифицировать меры ввода-вывода звездчатых клеток. Мы обнаружили, что нелинейные свойства мембраны, связанные с повышенным сопротивлением мембраны при суб- и перипороговых напряжениях, уменьшают модуляцию входных-выходных сигналов на основе флуктуаций.В целом, наши результаты показывают, что модуляция нейронных входов-выходов на основе флуктуаций может быть очень низкой, с ограниченным масштабированием выходных импульсов за счет изменений уровней шума и проводимости.

Результаты

Функции ввода-вывода звездчатых клеток слабо модулируются колебаниями мембранного напряжения

Чтобы исследовать модуляцию ответов ввода-вывода флуктуациями мембранного напряжения в звездчатых клетках MEC, мы начали с количественной оценки вызванных флуктуацией изменений в обычно используемых показателях нейронных ответов ввода-вывода.К ним относятся: наклон (усиление) и реобаза частоты-тока ( f-I ) и кривые вероятности выброса. Колебания напряжения генерировались с помощью колебаний на основе тока, которые были построены с использованием белого шума, отфильтрованного с помощью фильтра нижних частот (см. Методы). Для каждой ячейки мы записали короткий испытательный период, в течение которого амплитуда колебаний входного тока регулировалась для поддержания стандартного отклонения (SD) выходного напряжения в состоянии покоя (-75 мВ с поправкой на потенциал перехода электрода) примерно в 2 раза.5 мВ (2,41 ± 0,1 мВ), обычно наблюдаемое значение in vivo [33]. Контроль SD флуктуаций напряжения был важен, поскольку внутренние свойства нейронов зависят от напряжения, и справедливое сравнение различных клеток, условий и моделей требует, чтобы SD мембранного напряжения было постоянным. Кроме того, в предыдущей работе, направленной на решение аналогичных проблем, контролировались размеры флуктуации с точки зрения SD мембранного напряжения и использовались аналогичные значения [8,9,19,23,24,34,35],

Для кривых f-I частота всплесков была определена с использованием только первых трех интервалов между всплесками, чтобы избежать осложнений, возникающих из-за взаимодействия между временной шкалой колебаний напряжения и адаптацией частоты всплесков [21,23].Усиление рассчитывалось индивидуально для каждой ячейки с использованием наклона линейной аппроксимации (r ² : от 0,64 до 0,96, среднее значение: 0,89 ± 0,02) к соотношению fI , в то время как реобаза измерялась как ток, необходимый для выявления минимум 3 интервала между всплесками от напряжения удержания -75 мВ.

Как показано на рис. 1B, на кривые f-I звездчатой ​​ячейки влияние флуктуаций мембранного напряжения незначительно. Добавление флуктуаций вызвало небольшой, но незначительный сдвиг реобазы влево (рис. 1Ci; 199 ± 20 пА vs.158 ± 20 пА, p = 0,11, n = 20, 18). Как и в случае с реобазой, добавление флуктуаций напряжения не привело к значительному снижению усиления кривой fI (рис. 1Cii; 0,161 ± 0,10 пиков / пА с. Против 0,148 ± 0,08 пиков / пА с, P = 0,31, n = 20, 18). Для более точной количественной оценки потенциальных изменений на кривой f-I мы также измерили влияние колебаний напряжения на скорость зажигания в отдельных областях кривой f-I (рис. 1D; низкий, средний и высокий). Предыдущие моделирование и экспериментальные работы показали, что случайные колебания напряжения вызывают наибольшее увеличение скорости срабатывания в области с низкой частотой пиков кривой f-I , около перехода между режимом покоя и срабатыванием [8–10,19,20,24].Для наших данных нижняя область была определена индивидуально для каждой ячейки как частота всплесков разряда на реобазе, в то время как средняя и высокая области соответствовали значениям тока, вызывающим на 15 всплесков / с и 25 всплесков / с больше, чем исходная частота, соответственно. Для каждой ячейки мы измерили изменение скорости воспламенения, вызванное колебаниями напряжения для областей с низким, средним и высоким входным током, относительно кривой f-I той же ячейки, полученной без колебаний. Различия в частоте всплесков были небольшими, но значительно изменились в нижней и средней частях кривой f-I .Для нижней области кривой fI флуктуации вызывали увеличение на 3,3 ± 0,34 пика / с (рис. 1D; P <0,001, n = 18), в то время как в средней области эти значения составляли 3,2 ± 1,4 пика / с. (P = 0,03, n = 18).

Рис. 1. Отношения между входом и выходом звездчатых клеток MEC выражают низкую чувствительность к колебаниям напряжения на мембране.

(A) Типичные примеры реакции напряжения звездчатых клеток на скачки тока длительностью 1 с с (правая панель) и без (левая панель) флуктуациями мембранного напряжения.(B) График средних соотношений f-I в условиях, обозначенных в A. (C) Средние сдвиги влево реобазы (i) и усиления (ii) на кривых f-I в результате введения флуктуаций мембранного напряжения. (D) Изменение скорости воспламенения в результате колебаний мембранного напряжения для областей с низкой, средней и высокой частотой всплесков отношения f-I . Для каждой области изменения в скорости стрельбы были рассчитаны с использованием разницы в скорости стрельбы отдельной ячейки в результате введения колебаний входного тока.(E) Репрезентативные примеры реакции напряжения звездчатых клеток на 100 мс длительные шаги тока различной амплитуды с колебаниями мембранного напряжения и без них. (F) Средняя кривая вероятности выброса в присутствии колебаний мембранного напряжения. Вертикальная линия указывает среднюю реобазу при отсутствии колебаний напряжения для каждого условия.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004188.g001

Затем мы измерили влияние колебаний напряжения на кривые вероятности выброса.В отличие от кривой f-I , которая требует повторяющейся генерации пиков при каждом текущем размере шага, кривая вероятности пиков количественно определяет вероятность генерации только одного пика в пределах заданного временного окна (100 мс в нашем случае, рис. 1E и 1F). В отсутствие флуктуаций напряжения на мембране переход от нуля к единице в спайковом разряде почти всегда происходил в пределах одного шага тока (рис. 1F; вертикальная линия). Для экспериментов без искусственных колебаний напряжения амплитуда тока, связанная с этой точкой перехода, была определена как реобаза.Добавление флуктуаций напряжения сгладило взаимосвязь между вероятностями всплесков и шагами тока, так что точки данных могли соответствовать сигмовидной функции (рис. 1F; подгонка Больцмана, r ² > 0,96). При наличии колебаний напряжения реобаза определялась как ток, необходимый для установления вероятности 0,2 (P _0,2 ) генерации одиночного всплеска, в то время как наклон был определен количественно с использованием члена « k » в функции Больцмана (см. Методы). Как показано, колебания напряжения вызывали сдвиг реобазы влево относительно условий без колебаний (рис. 1F; 56 ± 5.6 pA, P <0,001, t-критерий Стьюдента, n = 20) и привели к кривым вероятности пика со средним наклоном 26 ± 8,4 pA (среднее ± s.e.m).

В целом, модификации кривых звездчатых клеток fI флуктуациями напряжения были небольшими по сравнению с предыдущими работами на других нейронах [8,9,23,24,35], без значительной модуляции прироста кривой fI в популяции и относительно небольшие изменения начальной скорости стрельбы. Для сравнения, в прошлых исследованиях с использованием колебаний напряжения аналогичной величины сообщалось о снижении усиления до 50% [8,9].Тем не менее, звездчатые клетки действительно демонстрируют некоторую степень модуляции входных-выходных реакций, опосредованной флуктуациями, на что указывает сдвиг и сглаживание кривой вероятности пика.

Звездчатые клетки проявляют значительные нелинейные мембранные свойства, приводящие к порогу спайков

Учитывая как теоретические, так и экспериментальные работы, подтверждающие сильную модулирующую роль флуктуаций мембранного напряжения, нас интересовало, какие факторы контролируют и ограничивают основанные на флуктуациях изменения откликов ввода-вывода в звездчатых клетках.В качестве потенциальной причины ограниченной модуляции входных-выходных сигналов на основе флуктуаций мы рассматривали роль нелинейных свойств мембраны, приводящих к порогу всплеска. В простых моделях было показано, что реалистичная динамика генерации пиков снижает вероятность реакции пиков на быстрые колебания напряжения [27,36]. Мы предположили, что распространение этого эффекта на гораздо большую область подпорогового напряжения, чем считалось ранее, могло бы значительно уменьшить модуляцию входных-выходных сигналов, основанную на флуктуациях.

Чтобы сначала установить наличие подпороговых нелинейных свойств мембраны в звездчатых клетках, мы количественно определили входное сопротивление мембраны между -85 мВ и -65 мВ. При каждом удерживающем напряжении сопротивление мембраны измеряли в режиме фиксации напряжения с шагом напряжения 5 мВ длительностью 100 мс. Деполяризация звездчатых клеток привела к прогрессивному увеличению входного сопротивления мембраны в стационарном состоянии (рис. 2А; односторонний дисперсионный анализ, P <0,001, n = 12). Сопротивление мембраны почти утроилось в диапазоне 20 мВ, увеличившись с 51.От 8 ± 3,9 МОм при -85 мВ до 151,4 ± 15,5 МОм при -65 мВ (рис. 2A). Следует отметить, что сопротивление также продолжало увеличиваться с дополнительной деполяризацией до такой степени, что очень маленькие скачки напряжения (~ 1 мВ) часто вызывали всплески на уровнях более деполяризованных, чем -65 мВ, и не позволяли точно измерить сопротивление мембраны при этих значениях напряжения.

Рис. 2. Звездчатые клетки проявляют нелинейные мембранные свойства, которые формируют траекторию напряжения, ведущую к порогу всплеска.

(A) Среднее входное сопротивление в установившемся режиме как функция мембранного напряжения.Измерения проводились в режиме фиксации напряжения с шагом 5 мВ длительностью 100 мс. (B) Средняя траектория мембранного напряжения (серые линии обозначают SEM), связанная с приближением от состояния покоя к первому всплеску. Для сравнения также показано экспоненциальное приближение с использованием измерений постоянной времени мембраны при -75 мВ. (C) Средняя траектория мембранного напряжения (серые линии обозначают SEM), связанная с межспайковым интервалом. (D) Типичный пример кривой f-V из звездчатой ​​ячейки (сплошная линия).Линия указывает соответствие степенной функции формы, показанной на вставке панели. На вставке также показан график среднего показателя степени ( p ) для аппроксимации степенной функции.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004188.g002

Затем мы проанализировали средние траектории мембранного напряжения, ведущие к порогу всплеска. Для токовых входов, вызывающих небольшие изменения напряжения (5 мВ), полученная траектория напряжения точно соответствовала экспоненциальной функции и использовалась для извлечения постоянной времени мембраны около -75 мВ (12.0 ± 0,9 мс, n = 19). Напротив, траектория мембранного напряжения до первого всплеска (для задержки первого всплеска 50 мс) при удерживающем напряжении -75 мВ (диапазон ~ 15 мВ) не может соответствовать экспоненциальной функции из-за более линейного профиля траектория (рис 2Б). Точно так же средняя траектория напряжения между минимумом постгиперполяризации (AHP) и порогом всплеска во время непрерывного срабатывания (~ 4 Гц) не была экспоненциальной (рис. 2C). Таким образом, траектории напряжения до порогового значения всплеска, начинающиеся либо с напряжений покоя, либо с минимума AHP, были относительно линейными по сравнению с ожидаемыми из наших измерений постоянной времени мембраны при -75 мВ.

Чтобы оценить, как изменения в частоте всплесков соотносятся с изменениями среднего напряжения, связанного с траекториями всплесков при различных частотах всплесков, мы количественно оценили взаимосвязь между частотой всплесков и средним напряжением ( f-V ). Как и в случае кривых f-I , частота выбросов для кривой f-V была взята из первых трех интервалов между спайками, при этом значения мембранного напряжения рассчитывались как среднее значение за тот же период времени. Неожиданно мы обнаружили, что кривые f-V были нелинейными и могли соответствовать степенной функции (рис. 2D; среднее значение r ² = 0.95 ± 0,02, диапазон: 0,7–0,99) с использованием показателя степени ( p ) 1,45 ± 0,08 (рис. 2D; n = 19, диапазон: 0,45–2,0, 17/19 имели p значений> 1). Кривые ячейки f-V также были неглубокими, со средним наклоном в диапазоне выстрела 4,5 ± 0,4 пиков / мВ · с (n = 19). Вопреки предыдущим предположениям [12,37], поэтому нейронные кривые f-V могут выражать значительное степенное масштабирование в отсутствие какого-либо сглаживания на основе флуктуаций. Таким образом, наши измерения сопротивления мембраны, траектории напряжения и кривые f-V показывают, что звездчатые клетки выражают значительные суб- и перипороговые нелинейности.

Постепенное увеличение сопротивления мембраны имеет решающее значение для уменьшения модуляции входных-выходных сигналов на основе флуктуаций в модели eLIF

Чтобы понять биофизические механизмы и последствия зависящего от напряжения сопротивления мембраны в большой области подпорогового напряжения, мы начали с изучения эффектов флуктуационной модуляции поведения ввода-вывода в упрощенной модели генерации спайков в форма экспоненциальной модели с утечкой, интегрированной и пожарной (eLIF) [27].Эта модель имеет преимущество включения важных нелинейных свойств мембраны, связанных с порогом спайков, с использованием небольшого набора параметров, которые связаны с физиологическими показателями (например, зависимое от напряжения подпороговое сопротивление мембраны).

Коэффициент наклона спайка (Δ _T ) в eLIF определяет изменение наклона кривой напряжение-ток мембраны ( IV ), когда напряжение на мембране приближается к порогу всплеска (V _T — Рис. .Экспоненциальный член моделирует увеличение сопротивления мембраны, связанное с увеличением активации проводимости Na ⁺ и генерации спайков. При малых значениях Δ _T наклон кривой I-V (сопротивление мембраны) резко изменяется по мере приближения системы к V _T (рис. 3A). И наоборот, при больших значениях Δ _T изменение наклона более плавное. Таким образом, для небольшого значения Δ _T (т.е.грамм. 2 мВ) кривая I-V в основном линейна, за исключением небольшого диапазона напряжений в непосредственной близости от V _T . Однако по мере увеличения Δ _T сопротивление мембраны постепенно увеличивается в относительно большом диапазоне подпороговых значений напряжения мембраны. Мы обнаружили, что значение Δ _T , равное 15 мВ, лучше всего соответствует экспериментальным значениям устойчивого входного сопротивления мембраны, наблюдаемого в звездчатых клетках (рис. 3B).Следует отметить, что значение 15 мВ для Δ _T является большим по сравнению с тем, что было реализовано в предыдущей работе (от 0,8 мВ до 6 мВ) с использованием модели eLIF для изучения корковых нейронов [27,38,39].

Рис. 3. Модель eLIF с большим значением Δ _T точно отражает свойства мембранного напряжения, наблюдаемые в звездчатых клетках.

(A) График кривых I-V для моделей eLIF с использованием различных значений Δ _T (2, 5, 15 мВ), а также полностью пассивной модели.(B) График входного сопротивления как функции мембранного напряжения для моделей, указанных в A . Обратите внимание, что средние значения звездчатых ячеек лучше всего соответствуют eLIF, используя значение Δ _T , равное 15 мВ. (C) Траектории напряжения для начального приближения спайков (i) и интервала между спайками (ii) для моделей, представленных в A. Для сравнения также показаны средние траектории звездчатых ячеек. (D) f-V кривые для моделей, обозначенных в A. (F) График сравнения экспериментальных значений показателя степенной функции в звездчатых клетках и модели eLIF с использованием Δ _T 15 мВ.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004188.g003

Мы начали со сравнения траекторий напряжения на мембране звездчатых клеток с траекториями, полученными в модели eLIF, используя Δ _T значения 2, 5 и 15 мВ. . Для сравнения мы также включили полностью пассивную модель (т. Е. Стандартную модель утечки интегрирования и возгорания — LIF), состоящую из члена линейной проводимости (15 нСм, -75 мВ реверсирование) и искусственного порога (-55 мВ). Для всех моделей напряжение мембраны было сброшено (V _r ) до -65 мВ после превышения порога.

Модель eLIF с Δ _T , равным 15 мВ, значительно лучше воспроизводит более линейный подход, связанный с начальным подходом к пиковому значению от -75 мВ (рис. 3Ci). Аналогичным образом, для траектории напряжения интервала между спайками между впадиной AHP и порогом спайка во время повторяющегося спайкового разряда (~ 4 Гц) значение Δ _T 15 мВ наилучшим образом отражает линейную траекторию, ведущую к порогу всплеска, наблюдаемому в звездчатых клетках. (Рис. 3Cii).По мере уменьшения Δ _T траектории напряжения, приближающиеся к порогу всплеска, становятся более экспоненциальными и качественно более похожими на пассивную модель (рис. 3C).

Учитывая различия в траекториях напряжения как в первоначальном подходе к пиковому напряжению, так и в траекториях между пиковыми напряжениями, нас интересовало, как среднее мембранное напряжение масштабируется со скоростью пикового напряжения ( f-V ) в каждой из моделей. Для пассивной модели кривая f-V крутая и имеет отрицательный наклон.В активных моделях наклон и форма значительно меняются при разных значениях Δ _T . Когда значение Δ _T увеличивается с 2 мВ до 15 мВ, наклон кривой f-V изменяется от отрицательного и крутого до мелкого и положительного (Рис. 3D). Кроме того, в диапазоне 1–60 пиков / с кривая f-V eLIF с использованием значения Δ _T , равного 15 мВ, может быть точно согласована с степенной функцией с показателем степени 1.78, что находится в пределах диапазона значений, наблюдаемых экспериментально для звездчатых клеток (рис. 3F).

Чтобы количественно оценить модуляцию откликов ввода-вывода колебаниями напряжения в моделях, мы сравнили результаты в модели eLIF, используя Δ _T значения 2 мВ и 15 мВ. Мы обеспечивали те же колебания входного тока, что и в звездчатых ячейках, и поддерживали колебания напряжения со стандартным отклонением 2,5 мВ при -75 мВ. Предыдущие исследования также установили, что увеличение проводимости мембраны с помощью различных механизмов, которые включают подавление шунтирования, сбалансированные синаптические проводимости или просто увеличение утечки через мембрану, облегчает модуляцию кривой f-I с использованием флуктуаций напряжения аналогичной величины [8-10,22].Кроме того, в результате разного наклона экспоненциальных членов модели eLIF с использованием Δ _T значений 2 мВ и 15 мВ имеют разные значения входного сопротивления при -75 мВ (рис. 3B), свойство, которое может учитывать потенциальные различия в модуляции входных-выходных сигналов на основе флуктуаций. По этим причинам в каждую из моделей был введен отдельный шунт или проводимость утечки ( г _L ) 15 нСм для проверки влияния увеличения проводимости мембраны на модуляцию ввода-вывода.

Модуляция на основе флуктуаций как для f-I , так и для кривых вероятности пиков существенно больше при использовании значения для Δ _T , равного 2 мВ, чем при 15 мВ (рис. 4). В соответствии с предыдущими расчетными и экспериментальными результатами [7–10], увеличение проводимости мембраны с помощью подавления шунтирования увеличивает вызванную флуктуацией модуляцию входных-выходных ответов в обеих моделях, хотя эффект намного больше, когда Δ _T = 2 мВ ( Рис 4).При Δ _T = 2 мВ, вызванное флуктуациями увеличение начальной частоты спайков составляет 23 спайка / с и 30 спайков / с ниже базового уровня и с повышенной проводимостью мембраны, соответственно (Рис. 4Bii – 4D). Для сравнения, с Δ _T = 15 мВ, это значение составляет всего 4,2 пиков / с и 5,8 пиков / с (рис. 4Bi – 4D). Аналогично, для кривых вероятности выброса флуктуации напряжения приводят к большим сдвигам влево и сглаживанию в обоих условиях проводимости с Δ _T = 2 мВ (рис. 4C – 4E).В результате изменения скорости возбуждения, реобазы и усиления, вызванные флуктуациями мембранного напряжения, более точно соответствуют тем, которые наблюдаются в звездчатых клетках, когда Δ _T установлено на 15 мВ (рис. 4D и 4E).

Рис. 4. Модель eLIF, использующая значение Δ _T , равное 15 мВ, генерирует ограниченную модуляцию входных-выходных характеристик флуктуациями мембранного напряжения.

(A) Примеры графиков моделей eLIF, реализованных с Δ _T = 15 мВ (i) и 2 мВ (ii).(B) fI кривые в моделях eLIF с Δ _T = 15 мВ (i) и 2 мВ (ii) с или без колебаний напряжения мембраны ниже базовой линии (черный) или повышенной проводимости мембраны ( г _шунт -серый). (C) Кривые вероятности всплеска в моделях eLIF с Δ _T = 15 мВ (i) и 2 мВ (ii) с или без колебаний мембранного напряжения ниже базовой линии (черный) или повышенной проводимости мембраны ( г _шунт -серый).(D) Изменения в скорости воспламенения, вызванные колебаниями мембранного напряжения для низких, средних и высоких областей кривых f-I для каждой модели. Для сравнения также показаны средние значения звездчатых клеток. (E) Графики изменений реобазы (i) и фактора наклона сигмовидной кишки (ii) в мерах вероятности всплеска, связанных с введением флуктуаций мембранного напряжения для каждой модели.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004188.g004

Уменьшение Δ _T также приводит к увеличению усиления кривой f-I (рис. 4B).Следовательно, увеличение вызванной флуктуацией модуляции кривых f-I с более низкими значениями Δ _T может быть результатом внутреннего более высокого значения усиления, которое обеспечивает большую чувствительность к изменениям колебаний входного тока. Предыдущие исследования установили, что уменьшение значения V _r имеет делительный эффект на усиление [40]. Поэтому, чтобы устранить влияние более высоких значений усиления, мы постепенно уменьшали значение V _r , чтобы уменьшить усиление, когда Δ _T было небольшим (рис. 5A).Используя этот подход, мы могли бы поддерживать примерно одинаковое усиление для разных значений Δ _T и проверить, полностью ли вызваны флуктуациями сглаживание кривой f-I из-за изменений внутреннего усиления (рис. 5A и 5B). Хотя компенсация усиления за счет изменений в V _r уменьшает модуляцию на основе флуктуаций кривой fI , более низкие значения Δ _T по-прежнему приводят к большему сглаживанию и увеличению начальной скорости стрельбы из fI кривая (рис. 5С).

Рис. 5. Уменьшение Δ _T в модели eLIF постепенно увеличивает модуляцию входных-выходных характеристик флуктуациями мембранного напряжения.

(A) Модель eLIF f-I Кривая усиления уменьшается с более отрицательным значением V _r . (B) Сравнение кривых f-I для различных значений Δ _T с (сплошные линии) и без (пунктирные линии) колебаниями мембранного напряжения. Обратите внимание, что более отрицательные значения V _r использовались для сохранения того же усиления с меньшими значениями Δ _T .(C) Изменения начальной скорости срабатывания кривых f-I , вызванные колебаниями мембранного напряжения для модели eLIF с использованием значений Δ _T . (D) Сравнение кривых вероятности всплеска для различных значений Δ _T с (сплошные линии) и без (пунктирные линии) колебаниями мембранного напряжения. (E) Графики изменений реобазы (i) и фактора наклона сигмовидной кишки (ii) при измерении вероятности всплеска, связанных с введением флуктуаций мембранного напряжения для моделей eLIF с использованием различных значений Δ _T .

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004188.g005

Для полноты картины мы также количественно оценили изменения в реобазе и наклоне кривых вероятности всплесков, вызванные введением флуктуаций напряжения (рис. 5D). Для этих мер выбор V _r не имеет значения. Как показано, постепенное уменьшение Δ _T с 15 мВ до 1 мВ приводит к постепенному увеличению как способности флуктуаций сдвигать реобазу, так и сглаживания кривых вероятности пика (рис. 5E).

Ограниченная модуляция входных-выходных сигналов на основе флуктуаций может быть воспроизведена в модели на основе проводимости с использованием формулизма Ходжкина и Хаксли.

Хотя модель eLIF с большим Δ _T дает очень хорошее соответствие экспериментальным результатам, полученным на звездчатых клетках, нас интересовало, может ли более биологически правдоподобная модель, использующая стандартный формулизм Ходжкина и Хаксли (HH), также воспроизвести наш результаты экспериментов. Для нашей модели на основе H-H мы начали с неинактивирующей проводимости Na ⁺ (I _Nap ), которая генерирует постепенное увеличение входного сопротивления мембраны при подпороговых мембранных напряжениях, наблюдаемых в звездчатых клетках (рис. 6A).Для пиковых токов мы использовали стандартный переходный ток Na ⁺ в сочетании с более медленным током K ⁺ (см. Методы). Обратите внимание, что значения реобаз в модели на основе проводимости отличались от модели eLIF, потому что порог напряжения для пиков был более деполяризован, чем для eLIF.

Рис. 6. Уменьшение постоянного тока Na ⁺ в модели проводимости, основанной на формулировке H-H, увеличивает модуляцию входных-выходных характеристик флуктуациями напряжения.

(A, B) График стационарного входного сопротивления мембраны (A) и частоты всплесков (B) как функции мембранного напряжения в модели для 3 различных уровней I _Nap (150 нСм, 75 нСм и 0 нС).(C) f-I отношения в модели на основе H-H с использованием 150 нСм (красный), 75 нСм (черный) и 0 нСм (голубой) с (сплошная линия) или без (пунктирная линия) колебаниями мембранного напряжения. (D) Изменение скорости воспламенения в результате колебаний мембранного напряжения для областей с низкой, средней и высокой частотой всплесков отношения f-I . (E) Кривые вероятности выброса в модели на основе H-H с использованием 150 нСм (красный), 75 нСм (черный) и 0 нСм (голубой) с (сплошная линия) или без (пунктирная линия) флуктуациями мембранного напряжения.(F) Графики изменений реобазы (i) и фактора наклона сигмовидной кишки (ii) на мерах вероятности всплеска в результате введения флуктуаций мембранного напряжения для модели на основе H-H с использованием различных уровней I _Nap .

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004188.g006

Как и ожидалось, уменьшение величины I _Nap снижает постепенное увеличение подпорогового входного сопротивления мембраны (рис. 6A). Кроме того, уменьшение I _Nap увеличивает наклон кривой f-V (рис. 6B).Следовательно, присутствие I _Nap заставляет модельный нейрон генерировать fV , более похожее на модель eLIF с Δ _T = 15 мВ, в то время как без I _Nap кривая fV имеет вид больше похоже на то, когда Δ _T = 2 мВ.

Чтобы оценить роль подпорогового сопротивления в модуляции на основе флуктуаций, мы изменили величину проводимости I _Nap . Как и раньше, мы добавили колебания входного тока, чтобы генерировать колебания напряжения с 2.5 мВ STD при -75 мВ. Как для измерений f-I (рис. 6C и 6D), так и для измерения вероятности всплеска (рис. 6E и 6F) снижение I _Nap приводит к постепенному увеличению способности колебаний мембранного напряжения модулировать отклики ввода-вывода. Таким образом, стандартная модель на основе H-H проводимости может воспроизводить экспериментальные результаты и наблюдения модели eLIF.

Большие значения Δ

Чтобы лучше понять, как значения Δ _T определяют траекторию мембранного напряжения, связанную как с начальным, так и с межспайковым интервалом всплеска, мы использовали графики фазовой плоскости для анализа модели eLIF с использованием значений Δ _T , равных 2 мВ. и 15 мВ.На графике на фазовой плоскости пунктирные линии указывают функцию производной мембраны ( d V / d t). Чем дальше значение пунктирной линии от оси абсцисс в нуле, тем быстрее изменяется напряжение на мембране. За счет своего влияния на форму линии d V / d t параметр Δ _T определяет скорость, с которой мембранное напряжение достигает порогового значения всплеска (рис. 7A и 7B). При Δ _T = 15 мВ функция d V / d t является неглубокой и генерирует небольшие значения, на что указывает близость к нулевой оси x, для большой части опережения траектории. до порога шипа; это приводит к тому, что траектория изменяется медленнее и занимает небольшую часть времени в непосредственной близости от порога выброса (рис. 7A).Уменьшение Δ _T увеличивает значения d V / d t для всех напряжений, ведущих к пороговому значению. В этих условиях траектория напряжения начинает замедляться только в непосредственной близости от порога всплеска и, следовательно, проводит большую часть интервала между всплесками в непосредственной близости от порога (рис. 7A и 7B; вставки).

Рис. 7. Значение Δ _T определяет чувствительность к колебаниям мембранного напряжения в модели eLIF путем установки скорости изменения мембранного напряжения и вероятности выброса разряда во время приближения к пороговому значению выброса.

(A, B) Графики в фазовой плоскости для модели eLIF с использованием Δ _T значений 15 мВ (A) и 2 мВ (B). Пунктирные линии указывают значение производной мембранного напряжения ( d, В, / d t), проданные линии и стрелки указывают траекторию и относительную скорость изменения (расстояние между стрелками). Меньшее значение Δ _T приводит к более высокой скорости изменения мембранного напряжения во время приближения к пороговому значению напряжения (минимум d V / d t line, V _T ).На вставках показана траектория мембранного напряжения, связанная с графиками фазовой плоскости в A и B . (C) График вероятности всплеска в ответ на колебания мембранного напряжения во время интервала между всплесками ~ 4 Гц для модели eLIF с использованием значения Δ _T , равного 15 мВ (красный) и 2 мВ (синий). (D) График кривых f-V для модели eLIF с использованием значения Δ _T 15 мВ (красный) и 2 мВ (синий) с (сплошные линии) и без (пунктирные линии) колебаний напряжения мембраны.(E) График траектории напряжения для различных уровней приложенного тока для модели eLIF с использованием Δ _T значений 15 мВ (вверху) и 2 мВ (внизу). Модель была решена с использованием начального условия -65 мВ и остановлена, когда было достигнуто значение -35 мВ. Цветные точки указывают среднее значение для каждой траектории напряжения. (F) График задержки 1 / первого всплеска в зависимости от среднего мембранного напряжения (среднее значение траекторий, показанных на F).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004188.g007

Приведенный выше анализ предполагает, что Δ _T влияет на основанную на флуктуации модуляцию функций ввода-вывода при заданном значении интервала между всплесками, устанавливая долю времени, в течение которой напряжение находится в непосредственной близости от порогового значения всплеска. По мере того, как Δ _T становится меньше, траектории напряжения проводят все большую часть времени вблизи порога напряжения для всплеска, в результате чего небольшие флуктуации могут привести к всплескам на очень ранней стадии развития траектории.И наоборот, путем линеаризации траектории большие значения Δ _T ограничивают вызванные флуктуацией всплески временными точками на более позднем этапе развития траектории напряжения. Чтобы проиллюстрировать это, мы количественно оценили вероятность того, что колебания напряжения вызывают всплески в разные моменты времени и напряжения в течение одной траектории интервала между всплесками (рис. 7C). Таким образом, каждая точка на траектории обеспечивала начальные условия, исходя из которых можно было вычислить вероятность генерации всплеска в данный момент напряжения и времени.Для каждой из этих точек мы запускали модели в течение периода времени 50 мс и рассчитывали вероятность всплесков разряда в ответ на колебания напряжения (SD = 2,5 мВ) в течение этого периода времени, используя 1000 испытаний (см. Методы). Как показано на фиг. 7C, для большей части интервала вероятность генерации всплеска в ответ на колебания напряжения существенно выше для Δ _T = 2 мВ, чем для Δ _T = 15 мВ. Хотя значение Δ _T = 15 мВ приводит к более высокой вероятности всплесков разряда к концу траектории межспайкового интервала, эффект ограничен во времени и проявляется в конце цикла, в результате чего влияние на частоту всплесков по сравнению с Детерминированный случай мал.

Влияние Δ _T на линию d V / d t также изменяет масштабирование между средним мембранным напряжением и частотой всплесков. Как указано выше, изменения в Δ _T изменяют линию d V / d t с большим значением Δ _T , генерируя более мелкую линию d V / d t. При добавлении положительного (деполяризующего) тока линия d V / d t перемещается вверх и от оси x, что приводит к более быстрой траектории напряжения (т.е.е. более короткие межспайковые интервалы).

Когда Δ _T = 2 мВ, траектория напряжения приближается к значениям, близким к пороговому ( В, _T ), быстрее, чем при Δ _T = 15 мВ. При Δ _T = 2 мВ производная мембраны замедляется только вблизи точки перегиба линии d V / d t. Следовательно, когда линия d V / d t сдвигается вверх, среднее значение траектории напряжения остается в значительной степени неизменным, поскольку большая часть траектории представлена ​​значением около точки перегиба линии d V / d. Линия т (рис. 7E и 7F).По сути, Δ _T = 2 мВ сжимает траекторию напряжения до значения, приблизительно равного В _{T .} При Δ _T = 15 мВ, однако, сдвиг вверх по линии d V / d t значительно ускоряет переменную напряжения для гораздо большей части профиля траектории, особенно для моментов времени на ранней стадии. траектории, удаленные от точки перегиба линии d V / d t.В результате среднее значение переменной напряжения деполяризуется по мере увеличения величины приложенного тока, и линия d V / d t смещается вверх (рис. 7E и 7F). Создавая неглубокий f-V , большой Δ _T ограничивает возможность изменения напряжения, вызванного случайными колебаниями, для увеличения частоты всплесков. И наоборот, когда Δ _T мало, а соотношение f-V крутое, колебания напряжения могут привести к значительному изменению частоты возникновения всплесков (рис. 7D).

При больших значениях Δ _T увеличение сопротивления мембраны и, как следствие, увеличение флуктуаций напряжения потенциально может преодолеть уменьшение модуляции на основе флуктуаций, установленное неглубоким соотношением f-V . Хотя стандартное отклонение флуктуаций мембранного напряжения больше в околопороговой области с Δ _T = 15 мВ по сравнению с Δ _T = 2 мВ _, , разница мала по сравнению с изменениями в Соотношение fV устанавливают путем увеличения значения Δ _T (фиг.8A).Таким образом, при среднем напряжении, когда колебания сначала вызывают пики в обеих моделях (~ -68 мВ), стандартное отклонение колебаний напряжения увеличивается только с 2,64 мВ до 3,06 мВ, когда Δ _T изменяется с 2 мВ до 15 мВ. Для сравнения, изменения в соотношении f-V намного больше. При Δ _T = 2 мВ диапазон 60 пиков / с происходит полностью в пределах диапазона 0,5 мВ, но увеличивается до диапазона 10 мВ, когда Δ _T = 15 мВ (рис. 7D). В результате увеличение Δ _T с 2 мВ до 15 мВ оказывает гораздо большее влияние на масштабирование соотношения f-V , чем размер колебаний мембранного напряжения.Даже в условиях, когда стандартное отклонение колебаний мембранного напряжения увеличивается до 3,6 мВ или 7,2 мВ (за счет увеличения колебаний входного тока), значения намного больше, чем те, которые используются с Δ _T = 2 мВ, модуляция Соотношения fV и fI все еще значительно меньше при Δ _T = 15 мВ, чем при Δ _T = 2 мВ (рис. 8B и 8C).

Рис. 8. Увеличение Δ _T оказывает большее влияние на масштабирование соотношения f-V , чем размер колебаний мембранного напряжения.

(A) График SD колебаний мембранного напряжения как функции среднего напряжения с использованием модели eLIF с Δ _T = 2 мВ и Δ _T = 15 мВ. SD флуктуаций мембранного напряжения больше с Δ _T = 15 мВ для значений напряжения, более деполяризованных, чем -70 мВ, из-за увеличения сопротивления мембраны. Гистограмма колебаний мембранного напряжения (Aii) в модели eLIF с использованием Δ _T = 2 мВ и Δ _T = 15 мВ при средних напряжениях -71.5 мВ и -68 мВ. Как показано, при -68 мВ SD колебаний мембранного напряжения больше (более широкое распределение), когда Δ _T установлено на -15 мВ. (B, C) Мелкая взаимосвязь fV с Δ _T = 15 мВ уменьшает модуляцию кривой fI на основе флуктуаций, даже когда колебания мембранного напряжения значительно больше, чем при Δ _T = 2 мВ. (B) График отношений f-V , созданных с колебаниями мембранного напряжения со значениями SD, равными 2.3 мВ, 3,6 мВ и 7,5 мВ (измерено при -75 мВ). На вставке показана гистограмма колебаний мембранного напряжения для трех значений SD. Чтобы увеличить размер колебаний напряжения, коэффициент колебаний входного тока был увеличен с 90 до 140 и 280. (C) Увеличение SD колебаний мембранного напряжения до 3,6 мВ и 7,5 мВ при Δ _T = 15 мВ генерирует меньшие изменения в скорости воспламенения по сравнению с Δ _T = 2 мВ, используя колебания напряжения со стандартным отклонением 2.6 мВ. На вставке показан график изменения скорости воспламенения, вызванный колебаниями напряжения для низких, средних и высоких областей (определенных, как и раньше) отношения f-I . Пунктирными черными линиями обозначены соотношения f-V (B) и f-I (C) при отсутствии колебаний мембранного напряжения.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004188.g008

Таким образом, большой Δ _T генерирует траектории напряжения, которые проводят меньшую часть времени в непосредственной близости от порога всплеска и среднее значение которых изменяется значительно с частотой всплесков.Обе характеристики являются результатом постепенного увеличения входного сопротивления мембраны и помогают уменьшить модуляцию входных-выходных характеристик колебаниями напряжения.

Снижение зависимости сопротивления мембраны от напряжения снижает модуляцию кривых ввода-вывода в звездчатых ячейках на основе флуктуаций

Наши измерения входного сопротивления, траектории напряжения и анализ модели eLIF позволили сформировать две проверяемые гипотезы относительно чувствительности выброса звездчатых клеток к колебаниям напряжения.Уменьшение увеличения входного сопротивления, связанного с деполяризацией в подпороговой области, должно привести к увеличению модуляции входных-выходных сигналов на основе флуктуаций. Эта манипуляция сродни уменьшению значения Δ _T . Во-вторых, манипуляции с сопротивлением мембраны с использованием отрицательной и положительной наклонных проводимостей должны приводить к снижению и увеличению, соответственно, флуктуационной модуляции входных-выходных откликов, манипулируя влиянием эндогенной отрицательной наклонной проводимости и изменяя траектории напряжения, связанные с приближение к шиповому порогу.

Предыдущая работа с другими нейронами установила, что стационарная проводимость Na ⁺ , опосредованная либо оконным током, либо постоянной проводимостью Na ⁺ , может существенно увеличивать сопротивление мембраны с деполяризацией [26,41]. Чтобы установить роль проводимости Na ⁺ в определении подпорогового входного сопротивления в звездчатых клетках, мы использовали небольшую концентрацию ТТХ (10 нМ), которая была способна значительно изменять подпороговое сопротивление мембраны, но также сохраняла способность генерировать хотя бы один шип.Применение TTX значительно снизило постепенное увеличение входного сопротивления при различных напряжениях (2-сторонний дисперсионный анализ, P <0,001, n = 12). При -65 мВ TTX снизил входное сопротивление с 151,4 ± 15,5 МОм до 65,9 ± 4,8 МОм (рис. 9A; P <0,001), не влияя на входное сопротивление ниже -70 мВ (рис. 9A; P> 0,32).

Рис. 9. Блок потенциалзависимой проводимости Na ⁺ увеличивает чувствительность к колебаниям мембранного напряжения в звездчатых клетках.

(A) Измерение входного сопротивления мембраны в установившемся режиме для различных контролируемых напряжений (черные квадраты) и с применением ТТХ ванны 10 нМ (серые кружки).(B) Пример кривых напряжения звездчатой ​​ячейки в ответ на шаг деполяризации 100 мс (i), а также среднее значение за первые 50 мс (ii) под контролем (черный) и с TTX (серый). На вставке (Bi) показана средняя доля времени, в течение которого траектория напряжения находилась выше средней точки для управления и под ТТХ с применением ванны. (C) Репрезентативные примеры ответа напряжения звездчатой ​​ячейки на 100 мс длительные шаги тока различной амплитуды с и без колебаний мембранного напряжения под ванной, применяемой TTX.(D) Кривые средней вероятности всплеска при наличии колебаний мембранного напряжения под контролем (черный) и 10 нМ TTX (серый). Вертикальные линии указывают на реобазу при отсутствии колебаний напряжения для каждого условия. (E) Графики среднего сдвига влево (i) и коэффициента наклона сигмовидной кишки (ii) для контроля (черные квадраты) и TTX (серые круги).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004188.g009

Затем мы оценили влияние активации проводимости Na ⁺ и зависящего от напряжения увеличения входного сопротивления на траектории мембранного напряжения, приводящей к шип.Поскольку траектория мембранного напряжения до первого всплеска от удерживающего напряжения -75 мВ не может быть описана экспоненциальной функцией (рис. 2B и рис. 9B), мы количественно оценили изменения траектории первого всплеска напряжения, измерив долю времени, затраченного выше середина траектории. Траектория с большой долей выше средней точки больше похожа на экспоненциальный подход. Среднее значение порога вычислялось для реакции каждой отдельной ячейки на квадратный текущий шаг, вызывающий задержку ~ 50 мс до первого всплеска.В присутствии TTX траектория напряжения находилась значительно больше времени выше средней точки по сравнению с контролем (рис. 9B; TTX: 0,84 ± 0,03 по сравнению с контролем: 0,68 ± 0,01, P <0,001, n = 6–18). ). К сожалению, 10 нМ TTX исключили возможность генерировать непрерывный импульсный разряд, который требуется для измерений кривой f-I . Как следствие, мы ограничили наш анализ выхода клеток в присутствии TTX кривыми вероятности пика. Как указано, колебания мембранного напряжения были более эффективными при сдвиге реобазы и сглаживании кривой вероятности пика в присутствии ТТХ (рис. 9D и 9E).Сдвиг реобазы влево увеличился с 64,4 ± 7,7 пА до 134 ± 25 пА (рис. 9Ei; парный t-критерий Стьюдента, P = 0,001, n = 10), а коэффициент наклона увеличился с 18,0 ± 1,3 пА до 29,6 ± 4,7 пА. (Рис. 9Eii; парный t-критерий Стьюдента, P = 0,02, n = 10). Эти результаты показывают, что уменьшение величины подпороговой проводимости Na ⁺ приводит к появлению более экспоненциально-подобных траекторий, что приводит к усилению модуляции кривых вероятности всплеска на основе флуктуаций.

Манипулирование проводимостью мембраны с помощью динамического зажима изменяет траектории напряжения и модуляцию входных-выходных характеристик колебаниями напряжения

Для дальнейшего исследования роли сопротивления мембраны и проводимости с отрицательным наклоном в формировании модуляции отклика ввода-вывода за счет колебаний напряжения, мы манипулировали сопротивлением мембраны в звездчатых клетках с помощью динамического зажима, вводя искусственные проводимости с отрицательным или положительным наклоном.В частности, нас интересовали эффекты отрицательного наклона проводимости, поскольку способность проводимости Na ⁺ увеличивать входное сопротивление и замедлять скорость изменения напряжения мембраны связана с отрицательным наклоном, связанным с Na ⁺ IV. отношения [26]. Следовательно, введение искусственной проводимости с отрицательным наклоном должно еще больше уменьшить основанную на флуктуации модуляцию входных-выходных сигналов. И наоборот, добавление положительной наклонной проводимости должно увеличивать модуляцию посредством флуктуаций напряжения за счет уменьшения влияния эндогенно выраженной отрицательной наклонной проводимости.

Для отрицательной наклонной проводимости мы использовали значение -5 нСм, которое было максимальным значением, которое можно было добавить без возникновения нестабильности, и которое увеличило сопротивление мембраны, измеренное при -75 мВ, с 68,9 ± 8,9 МОм до 102 ± 13 МОм. Положительная проводимость была установлена ​​на 15 нСм, а сопротивление мембраны снизилось до 34,1 ± 2,7 МОм. Для положительной проводимости значения более 15 нСм приводили к потере непрерывного всплеска, аналогично тому, что сообщалось в пирамидных клетках CA1 с использованием этой манипуляции [42,43].И отрицательная, и положительная проводимость были линейными с реверсивным потенциалом -75 мВ.

Как и в случае с экспериментами TTX, мы количественно оценили изменения траекторий первого всплеска напряжения, используя долю времени выше средней точки. Изменения в проводимости мембраны оказали значительное влияние на траекторию, ведущую к порогу спайков (рис. 10А; односторонний дисперсионный анализ, P <0,001, n = 8–18). Отрицательная проводимость уменьшила долю времени выше средней до 0,59 ± 0,02, а добавление положительной проводимости увеличило это значение до 0.82 ± 0,02 (рис. 10В; P <0,001, тест Тьюки).

Рис. 10. Изменения траектории напряжения начального пика и межспайкового интервала при использовании динамического фиксатора.

(A) Средние траектории мембранного напряжения для начального приближения к спайку в звездчатых клетках при -5 нСм (красный), контрольный (черный) и 15 нСм искусственной проводимости мембраны, добавленные с динамическим зажимом. Более тонкие линии обозначают сем. (B) График средней доли выше средней точки для начальных траекторий пикового напряжения с использованием -5 нСм, контроля и 15 нСм уровней искусственной проводимости мембраны.(C) Средние траектории мембранного напряжения в звездчатых клетках с использованием динамического зажима с -5 нСм (красный), контроль (черный) и 15 нСм (синий) искусственной проводимости мембраны. (D) График средней полупериод продолжительности AHP для траекторий межспайкового интервала напряжения при -5 нСм, контроле и 15 нСм искусственной проводимости мембраны.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004188.g010

Изменение проводимости мембраны также оказало значительное влияние на продолжительность AHP, связанного с непрерывным возбуждением на частоте ~ 4 Гц (рис. 10C; односторонний дисперсионный анализ ANOVA, Р <0.001, n = 9–12). Отрицательная проводимость привела к значительному увеличению полупериода AHP (время от минимума до средней точки напряжения между минимальным и импульсным порогом, рис. 10D; 98,1 ± 5,3 мс, P <0,001, тест Тьюки). Хотя положительная проводимость не приводила к значительному изменению полупериода AHP по сравнению с контролем при принятии во внимание повторных измерений, наблюдалось снижение средних значений (43,4 ± 4,5 мс, P = 0,07, критерий Тьюки). Следовательно, в целом, изменения в проводимости мембраны изменили продолжительность траекторий мембранного напряжения, приводящего к порогу всплеска, в форме, соответствующей нашему анализу модели eLIF.

Затем мы количественно оценили влияние отрицательных и положительных изменений в проводимости мембраны на модуляцию на основе флуктуаций кривых входа-выхода звездчатых клеток. Для каждого уровня проводимости мы сравнили изменения наклона и реобазы f-I и кривые вероятностей пиков, вызванные введением флуктуаций мембранного напряжения. Как и раньше, колебания мембран поддерживались на уровне SD ~ 2,5 мВ (-5 нСм, 2,3 ± 0,1 мВ, контроль: 2,41 ± 0,1 мВ; 15 нСм: 2,35 ± 0,01 мВ, n = 5, 19, 18).Анализ кривых fI показал, что усиление в значительной степени модулировалось изменениями проводимости мембраны, но не введением флуктуаций мембранного напряжения (рис. 11A и 11B; двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA, P <0,001 для проводимости, P = 0,36 для колебаний напряжения. ). Вопреки ожиданиям [8,9,44,45], усиление кривой f-I можно модулировать, хотя и умеренно, только путем изменения проводимости мембраны. Что еще более важно, кривые звездчатых ячеек f-I поддерживали низкую степень модуляции на основе флуктуаций на всех трех уровнях проводимости.Следует отметить, что модель eLIF, использующая Δ _T = 15 мВ, но не Δ _T = 2 мВ, также дает небольшое уменьшение усиления при увеличении проводимости мембраны. Этот результат связан с изменениями в среднем межспайковом интервале мембранного напряжения, вызванными изменениями проводимости, когда Δ _T = 15 мВ, но не Δ _T = 2 мВ.

Рис. 11. Модуляция входных-выходных сигналов звездчатых клеток с искусственным изменением проводимости мембраны, реализованная с помощью динамического зажима.

(A) График средних кривых звездчатой ​​ячейки f-I с использованием уровней искусственной проводимости -5 нс (красный), контрольный (черный) и 15 нс (синий), а также при наличии и отсутствии колебаний напряжения на мембране. (B) График среднего усиления, измеренного с использованием линейной регрессии с использованием -5 нСм, контроль и 15 нСм с (открытые символы) и без (закрытые символы) колебаниями мембранного напряжения. (C) Изменение реобазы (i) и начальной скорости всплеска (ii) в кривых звездчатых клеток f-I в результате введения флуктуаций мембранного напряжения с -5 нСм, контроль и 15 нСм дополнительной проводимости.( D ) График средних кривых вероятности спайков звездчатых клеток при -5 нс (красный), контрольный (черный) и 15 нс (синий) с флуктуациями мембранного напряжения и без них. (E) Изменение реобазы (i) и фактора наклона сигмовидной кишки (ii) на кривых вероятности спайков звездчатых клеток ниже -5 нСм, контроль и 15 нСм в результате введения флуктуаций мембранного напряжения.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1004188.g011

Мы приступили к измерению изменений реобазы и начальной скорости воспламенения, связанных с кривыми f-I в результате колебаний напряжения при каждом из условий проводимости.Изменения проводимости мембраны значительно повлияли на способность искусственных колебаний изменять реобазу (рис. 11Ci; P <0,02, однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, P = 0,01, тест Тьюки). Кроме того, колебания напряжения не смогли значительно снизить значения реобазы в присутствии -5 нСм проводимости (рис. 11Di; t-критерий Стьюдента для одного образца, P = 0,58), тогда как при 15 нСм реобаза значительно увеличилась (рис. 11Di; один образец Стьюдента). t-критерий, P <0,001). Как и в случае с реобазой, изменения в начальной скорости стрельбы спайков также были значительно изменены проводимостью мембраны (рис. 11Dii; P = 0.001, однофакторный дисперсионный анализ), при этом каждый уровень проводимости генерирует значительные различия в начальных скоростях возникновения спайков (рис. 11Cii; P <0,01, критерий Тьюки). При -5 нСм флуктуации напряжения проводимости не смогли значительно увеличить скорость срабатывания от нуля (рис. 11Cii; t-критерий Стьюдента для одного образца, P = 0,79), в то время как эти изменения были значительными под контролем и с 15 нСм (рис. 11Cii; один образец T-критерий Стьюдента, P <0,001).

Изменения, вызванные флуктуациями в кривых вероятности пиков, отражали изменения, наблюдаемые на кривых f-I (рис. 11D и 11E).Как для реобазы, так и для фактора наклона проводимость оказала значительное влияние (рис. 11Ei и 11Eii; P <0,001, однофакторный дисперсионный анализ). Увеличение проводимости мембраны на 15 нСм привело как к увеличению способности флуктуаций напряжения сдвигать реобазу, так и к сглаживанию кривых вероятности пика (рис. 11E). При уменьшении проводимости мембраны (-5 нСм) изменения и сглаживание реобаз были менее выраженными (рис. 11D и 11E).

В целом, эти результаты согласуются с нашей гипотезой и указывают на то, что более медленная и более линейная траектория напряжения, установленная увеличением сопротивления мембраны за счет отрицательной крутизны проводимости, снижает модуляцию отклика ввода-вывода колебаниями напряжения.Кроме того, линеаризация траекторий напряжения фундаментально связана с отрицательной крутизной проводимости, связанной с активацией тока Na ⁺ . Наши данные показывают, что нелинейные свойства мембраны формируют потенциал для колебаний напряжения, чтобы модулировать реакции ввода-вывода нейронов.

Обсуждение

Наше исследование демонстрирует результаты, которые имеют важное значение для модуляции ввода-вывода отдельных ячеек через изменения проводимости мембраны и колебания напряжения.Во-первых, реакции ввода-вывода звездчатых клеток модулируются в небольшой степени флуктуациями мембранного напряжения в контролируемых условиях, а также повышенной проводимостью мембраны. Во-вторых, как в моделях, так и в звездчатых клетках, зависящий от напряжения внутренний ток, возникающий в результате отрицательной наклонной проводимости, которая активируется в значительной подпороговой и перипороговой областях, отвечает за низкие уровни модуляции входных-выходных сигналов, опосредованной флуктуациями. Наконец, отрицательная крутизна проводимости уменьшила вызванные флуктуацией изменения в отклике ввода-вывода за счет линеаризации и замедления траекторий мембранного напряжения, что также привело к образованию неглубокой и нелинейной кривой f-V .

Управление выбросом нервных импульсов с помощью колебаний мембранного напряжения и изменений проводимости мембраны

Колебания мембранного напряжения и изменения проводимости мембраны (например, ингибирование шунтирования) считаются ключевыми факторами, которые контролируют масштабирование нейронального ввода-вывода [7–9,11,45]. Общепринятая роль колебаний напряжения заключается в снижении порога выброса и усилении слабых входных сигналов [5,6]. Таким образом, размер и спектральный состав колебаний напряжения можно использовать для потенциально стробирующих входов, как это предлагается некоторыми сетевыми моделями [46].Кроме того, флуктуирующий ток на входе может раздельно масштабировать кривую f-I за счет непропорционального увеличения частоты срабатывания импульсов вблизи порогового значения [5,7–10]. Более того, было показано, что в условиях спайков, вызванных флуктуациями, частота спайков может масштабироваться с подпороговым мембранным напряжением для значимой части динамического диапазона клетки [9,10]. По этой причине при наличии значительных колебаний напряжения ожидается, что изменения в подпороговом соотношении IV , вызванные подавлением шунтирования, уравновешиванием возбуждающей и тормозной проводимости или просто введением проводимости утечки, приведут к дальнейшему снижению наклон кривой fI .Считается, что изменения наклона кривой fI имеют решающее значение для настройки кривой настройки отдельных клеток, и было предложено сыграть решающую роль в сенсорной обработке, особенно в зрительной системе, в отношении настройки спайкового ответа нейронов на контраст [3,12,37,45]. Таким образом, синаптические колебания напряжения участвуют в установке как порогового значения нейрональных импульсов, так и общего масштабирования отношений ввода-вывода.

Данные гранулярных клеток мозжечка [9] и моделирование на основе компартментных моделей [10] убедительно продемонстрировали, что частота спайков действительно может масштабироваться с подпороговым мембранным напряжением после добавления колебаний напряжения.В гранулярных ячейках, например, флуктуации позволяют генерировать всплески в диапазоне более 100 всплесков в секунду при том, что в противном случае было бы подпороговыми значениями напряжения при отсутствии флуктуаций. Наши данные, однако, предполагают, что этот сценарий нельзя обобщать, по крайней мере, в пределах физиологических колебаний напряжения. В случае звездчатых клеток и нашей модели eLIF (Δ _T = 15 мВ) масштабирование частоты всплесков с подпороговым мембранным напряжением сильно ограничено из-за очень мелкого соотношения фВ и , которое ограничивает диапазон частот всплеска. в котором колебания напряжения могут вызывать всплески.В соответствии с нашей интерпретацией, гранулярные клетки имеют очень крутые кривые f-V в отсутствие значительных флуктуаций напряжения на мембране, с диапазоном 250 пиков / с, возникающим при менее чем 2,5 мВ [9]. Аналогичным образом, моделирование, поддерживающее этот механизм [10], было выполнено в компартментальной модели, также выражающей крутое соотношение f-V (80 пиков / с более ~ 2,5 мВ). Напротив, звездчатые клетки и модель eLIF (Δ _T = 15 мВ) генерируют кривые f-V с наклоном в диапазоне 4–5 пиков / мВ.Таким образом, представленные здесь результаты показывают, что характеристики кривой f-V и ее связь с траекториями напряжения, ведущими к всплескам, имеют решающее значение для понимания того, в какой степени нейронные функции ввода-вывода модулируются колебаниями напряжения.

Степенное масштабирование кривой f-V звездчатой ​​ячейки без колебаний напряжения

В зрительной системе степенное масштабирование между частотой импульсов импульсов и мембранным напряжением пирамидных нейронов слоя II является критическим для контроля усиления и инвариантности контраста [12,37].Моделирование показало, что степенное масштабирование с показателем, близким к 2, между частотой возникновения пиков и напряжением может возникнуть в результате комбинации внутреннего, крутого и линейного соотношения fV и сглаживания колебаний напряжения, распределенных по Гауссу [3,19, 34,47]. В отличие от прошлых предположений, наши данные показывают, что кривая f-V плохо аппроксимируется крутой линейной функцией, и что часть нелинейного масштабирования между частотой всплесков и напряжением может быть результатом внутренних свойств мембраны, зависящих от напряжения.

Для модели eLIF, использующей Δ _T = 15, постепенная активация отрицательной наклонной проводимости играет решающую роль в настройке неглубокой нелинейной кривой f-V . При постепенной активации деполяризация приводит к изменению среднего напряжения при различных скоростях разряда пиков. Это связано с тем, что на скорость изменения напряжения сильно влияет активация отрицательной крутизны проводимости. По мере того, как постепенно активируются все большие значения отрицательной крутизны проводимости, форма и среднее значение траектории напряжения между импульсами значительно изменяются.Это не относится к Δ _T = 2 мВ, потому что траектория напряжения на разных частотах в значительной степени определяется пассивными свойствами мембраны, что приводит к экспоненциальному подходу, который не претерпевает изменения среднего с увеличением уровня. деполяризации и скорострельности.

Значение для функции сети MEC

Звездчатые клетки участвуют в пространственной навигации через их сетчатые пространственные поля запуска [48]. Возможно, что низкая степень модуляции откликов ввода-вывода флуктуациями мембранного напряжения в звездчатых клетках помогает поддерживать стабильные схемы возбуждения по отношению к пространственному положению.Уменьшая влияние быстрых колебаний напряжения на скорость возбуждения и реакции ввода-вывода, поведение звездчатых клеток, вероятно, способствует повышению надежности входов, непосредственно связанных с соответствующей сетевой активностью [31,32]. В соответствии с этой интерпретацией, наша предыдущая работа по синхронизации спайк-фазы в звездчатых клетках продемонстрировала очень высокую степень синхронизации спайк-фазы для медленных (1–10 Гц) колебательных входов в присутствии случайных флуктуаций напряжения и повышенной проводимости мембраны [49]. .

Роль Na

Ключевым фактором в уменьшении модуляции ввода-вывода флуктуациями мембранного напряжения в звездчатых клетках является постепенная активация проводимости Na ⁺ . При замедлении приближения к порогу выброса постепенная активация проводимости Na ⁺ приводит к тому, что напряжение на мембране оказывается дальше от порогового значения для большой части траектории.Ввод тока, связанный с измерениями кривой f-I , приводит к постепенному изменению среднего напряжения и небольшому постепенному увеличению скорости стрельбы, что приводит к неглубокому соотношению f-V . И модель LIF, и модель eLIF, реализованные с небольшими значениями Δ _T , выражают линейные подпороговые свойства мембраны. Это приводит к экспоненциальному приближению к пороговому значению, при котором напряжение на мембране рано выходит на плато, и большая часть времени тратится около порога всплеска.В результате небольшие изменения входного тока и напряжения мембраны приводят к большим изменениям скорости стрельбы.

Помимо звездчатых клеток, кортикальные нейроны в зрительной коре [39], клетки Пуркинье мозжечка [50] и интернейроны полосатого тела [51] демонстрируют постепенное увеличение сопротивления мембраны с деполяризацией, которая опосредуется током Na ⁺ . Следовательно, поведение, наблюдаемое в звездчатых клетках, вероятно, применимо к широкому кругу различных нейронов.

С точки зрения нелинейной динамики, увеличение сопротивления мембраны, которое приводит к области отрицательной наклонной проводимости вблизи порога, согласуется с бифуркацией седло-узел.Эта бифуркация часто связана с характеристиками типа I, присутствующими в корковых пирамидных клетках [52]. С другой стороны, быстродействующие интернейроны коры головного мозга были классифицированы как тип II, с пороговым поведением, часто моделируемым с использованием бифуркации Хопфа и, следовательно, не требующим увеличения сопротивления мембраны [52,53]. Предыдущие моделирование и экспериментальные исследования показали, что поведение типа I способствует высокой чувствительности к колебаниям мембранного напряжения [18,52,54]. К сожалению, выявить четкую взаимосвязь между степенью модуляции входных-выходных характеристик флуктуациями напряжения и типом пороговой бифуркации затруднительно.Наш механизм требует постепенного увеличения удельного сопротивления мембраны в диапазоне 20 мВ, в то время как определение между седло-узлом и бифуркацией Хопфа устанавливается в непосредственной близости от порога спайка, который часто меньше 1 мВ. Однако флуктуации напряжения in vivo могут охватывать диапазон более 10 мВ, так что интегральное поведение клетки в больших областях подпорогового напряжения, которые находятся далеко за пределами непосредственной близости от порогового значения всплеска, становится решающим для понимания того, как клетка реагирует на колебания напряжения.По этим причинам мы полагаем, что любая форма и тип бифуркации могут привести к низкой или высокой чувствительности реакции ввода-вывода к случайным колебаниям напряжения.

Материалы и методы

Заявление об этике

Все экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Юты.

Препарат ткани

Горизонтальные срезы гиппокампа и энторинальной коры получали от 25-50-дневных крыс Long-Evans любого пола.Все химические вещества были получены от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури), если не указано иное. После анестезии изофлураном и декапитации мозг извлекали и погружали в раствор искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) при 0 ° C, состоящий из следующего: (в мМ): NaCl (125), NaHCO ₃ (25), D-глюкоза ( 25), KCl (2), CaCl ₂ (2), NaH ₂ PO ₄ (1,25), MgCl ₂ (1) и забуференный до pH 7,4 с 95/5% O ₂ / CO ₂ газ. Горизонтальные срезы нарезали толщиной 400 мкм (Leica VT 1200, Leica Microsystems; Wetzlar, Германия).После процедуры нарезки срезы инкубировали в ACSF при 30 ° C в течение 20 минут перед охлаждением до комнатной температуры (20 ° C). После инкубационного периода срезы переносили на предметный столик инфракрасного дифференциального интерференционного контрастного микроскопа (Axioscope 2+; Zeiss, Оберкохен, Германия). Все записи проводились при температуре от 32 до 34 ° C.

Электрофизиология

Электроды вытягивали на горизонтальном съемнике (P97; Sutter Instruments, Novato, CA) и заполняли внутриклеточным раствором, состоящим из следующих веществ (в мМ): K-глюконат (120), KCl (20), HEPES (10), diTrisPhCr (7), Na ₂ ATP (4), MgCl ₂ (2), Tris-GTP (0.3), EGTA (0,2) и забуференный КОН до pH 7,3. Сопротивление конечных электродов составляло от 2 до 5 МОм, а значения сопротивления доступа составляли от 5 до 16 МОм. Компенсация баланса моста использовалась для всех записей. Значения сопротивления уплотнения всегда превышали 1 ГОм. Электрофизиологические записи выполнялись с помощью усилителя с токовыми фиксаторами (Axoclamp 2B; Molecular Devices, Юнион-Сити, Калифорния), а данные были получены с использованием специального программного обеспечения, разработанного в Matlab (v.2011, Mathworks, Натик, Массачусетс) с использованием набора инструментов для сбора данных.Расчетный потенциал перехода в 10 мВ был вычтен для анализа данных. Таким образом, средний потенциал покоя, описанный здесь (-75 мВ), на 10 мВ более гиперполяризован, чем описанный в других местах для звездчатых клеток [55,56].

Идентичность звездчатых клеток была установлена ​​с использованием следующих критериев: 1) наличие провала мембранного напряжения, обусловленного гиперполяризацией, 2) измерения импеданса и резонанса, указывающие на установившееся входное сопротивление в состоянии покоя между 35 МОм и 80 МОм и наличие ~ Пик резонанса 5 Гц, определенный с использованием методов, описанных ранее [49] и 3) расположение и морфология клеток с помощью оптики DIC-IR (т.е.е. во II слое МЭК и с непирамидальной формой тела клетки).

Для экспериментов с ограничением напряжения мы держали ячейки при каждом соответствующем напряжении (от -85 до -65 мВ), использовали небольшой шаг (5 мВ) и измеряли изменение тока. Отношение изменения напряжения и тока использовалось для измерения входного сопротивления при каждом соответствующем удерживающем напряжении.

Для экспериментов с динамическими зажимами усилитель с токовыми фиксаторами управлялся аналоговым сигналом от персонального компьютера x86, работающего под управлением прикладного интерфейса реального времени Linux и экспериментального интерфейса реального времени (RTXI) [57,58].Ингибирование шунтирования ( I _дюйм ) было реализовано с использованием RTXI по следующему уравнению: Для этих экспериментов E _дюйм и г _дюйм были установлены на -75 мВ и 15 нс, соответственно. В случае отрицательной проводимости (рис. 10 и 11) член г _дюйм был установлен на -5 нСм. Для всех экспериментов частота дискретизации динамического зажима была установлена ​​на 10 кГц. Измеренный потенциал перехода приблизительно 10 мВ был вычтен из всех записей.Данные собирали при 10 кГц и фильтровали при 3 кГц. Колебания входного тока были реализованы с помощью фильтрованного белого шума с использованием фильтра нижних частот ( f _срез = 100 Гц). Текущий сигнал был построен в частотной области с использованием масштабирования амплитуды частоты ( A ( f )) A ( f ) = 1 / (1+ ( f / f _cut )). Функция Matlab ifft использовалась для реализации обратного преобразования Фурье и генерации временных рядов из сигналов, построенных в частотной области.Для каждой ячейки мы записали короткий испытательный период, в течение которого колебания входного тока регулировались для поддержания стандартного отклонения (SD) колебаний мембранного напряжения в состоянии покоя (-75 мВ) на уровне ~ 2,5 мВ.

Для блока каналов Na ⁺ применяли ванну с тетродотоксином (TTX, Tocris, Бристоль, Великобритания) в концентрации 10 нМ. Записи с ТТХ проводились примерно через 15 минут после нанесения препарата в ванне.

Симуляции и модели

Для модели экспоненциальной утечки, интегрирования и возгорания (eLIF) [27], динамика мембранного напряжения регулируется следующим дифференциальным уравнением: где C = 170 пФ , V _T = -60 мВ , g _{L =} 25 нСм, E _L = -75 мВ и Δ _T = 15 мВ (по умолчанию).Обратите внимание, что для пассивной версии модели (т. Е. Стандартной утечки интегрировать и воспламенять) первый член г _L был установлен на ноль, а отдельный член утечки использовался с тем же обратным потенциалом и с использованием значение проводимости 15 нСм. Это значение проводимости создает пассивную модель с тем же входным сопротивлением, что и модель eLIF при -75 мВ. Из-за экспоненциального члена в eLIF, напряжение на мембране расходится до бесконечности при пересечении V _T .Для моделирования eLIF напряжение мембраны было сброшено до V _R (-65 мВ) при достижении значения 0 мВ. В пассивной модели отсутствуют истинные пороговые явления, поэтому искусственный порог был установлен на -55 мВ, а напряжение на мембране было сброшено до -65 мВ после пересечения этого порогового значения. Все модели были смоделированы в Matlab и решены прямым методом Эйлера с шагом по времени 0,01 мс. Мы также протестировали модельные решения с шагом по времени 0,001 мс и получили те же результаты.

Для модели, основанной на формулировке H-H (рис. 6), мембранное напряжение определялось следующими уравнениями: где C = 170 пФ, τ _n = 3 мс, E _Na = 50 мВ, E _K = -90 мВ, E _L = -80 мВ, г _Na = 170 нСм, г _K = 90 нс, г _Nap = 150 нС и г _течь = 20 нСм.Чтобы уменьшить размерность модели, мы использовали приближение, что h ≈ 1-n и что m и p мгновенно уравновешиваются с мембранным напряжением, поскольку их постоянные времени меньше постоянной времени мембраны.

Как и в экспериментах, колебания тока генерировались с использованием фильтрованного белого шума, генерируемого с использованием того же уравнения и частоты отсечки (100 Гц), что и в экспериментах. Чтобы гарантировать стандартное отклонение 2,5 мВ при напряжении -75 мВ, каждая модель испытывалась с постепенно увеличивающимися коэффициентами шума до стандартного отклонения 2.5 мВ было надежно измерено в небольшой области значений коэффициента при -75 мВ в течение 15 с. Колебания тока были добавлены к члену постоянного тока ( I _e ) в приведенном выше уравнении (т. Е. Аддитивный шум). Чтобы увеличить модельную проводимость мембраны, был добавлен отдельный член г _L с использованием реверсивного потенциала -75 мВ.

Анализ и статистика

Все анализы проводились в Matlab с использованием специального программного обеспечения и / или встроенных функций.Для аппроксимации степенного закона и соответствия Больцмана мы также подтвердили соответствие в Origin 8.5 (OriginLab, Нортгемптон, Массачусетс). Время всплеска определяли с использованием порогового значения для мембранного напряжения. Частоту всплесков определяли с использованием среднего значения, обратного первым трем интервалам между всплесками, полученным из одной или двух секундных шагов тока. Средние значения усиления были определены путем усреднения отдельных значений наклона, полученных с использованием линейного регрессионного анализа отношения f-I . Значения реобазы рассчитывались как минимальный ток, необходимый для вызова 4 пиков от удерживающего напряжения -75 мВ.Для иллюстрации средних кривых f-I , показанных на рис. 1 и 8, мы откалибровали начальную точку кривой f-I таким образом, чтобы начальное значение каждой ячейки было близко к средней реобазе, рассчитанной для данного условия. Для кривых вероятности всплеска текущая длительность шага составляла 100 мс, и каждый текущий размер шага повторялся от 15 до 25 раз, при этом вероятность всплеска определялась как количество шагов, вызвавших всплески, деленное на общее количество шагов. Индивидуальные кривые вероятности выброса ( P ( I )) были подогнаны с помощью функции Больцмана следующим образом: где P — вероятность выброса пика, I _{половина} — текущее значение размера шага, необходимое для выявления 0.Вероятность 5 ( P, _0,5 ) пиковой разрядки и k — наклон (большие значения обозначают меньший наклон) кривой. Подгонки использовались для расчета коэффициента наклона ( k ), в то время как реобаза для кривых вероятности была определена как текущий размер шага, необходимый для выявления P _0,2 в импульсном разряде.

Для кривой f-V результаты экспериментов и моделирования были подобраны с использованием степенной функции: где f — интенсивность стрельбы, p — показатель степени соответствия, указанный в разделе результатов, a и b — положительные константы, а V _C — минимальное напряжение, необходимое для выявления генерация шипа.Обратите внимание, что член a был ограничен так, что были возможны только значения 1 или больше. Все аппроксимации использовали метод наименьших квадратов.

Чтобы количественно оценить влияние флуктуаций мембранного напряжения на импульсный разряд в моделях во время непрерывного выброса (рис. 7C), мы сначала рассмотрели периодический выброс модельного элемента в отсутствие случайных колебаний (с периодом ~ 270 мс) и определили долю интервала как время интервала между всплесками, деленное на общий период. В каждой заданной части интервала мы брали детерминированное состояние модели (значение для напряжения и всех других переменных) и использовали его в качестве начального условия для набора из 1000 тестовых имитаций, каждые 50 мс длительностью, в которые затем добавлялись флуктуации.