Поджелудочная железа человека: Поджелудочная железа и симптомы заболевания

Островки Лангерганса содержат альфа-, бета- и дельта-клетки, которые продуцируют соответственно глюкагон, инсулин и соматостатин.Клетки островков четвертого типа, клетки F (или PP), располагаются на периферии островков и секретируют панкреатический полипептид. Эти гормоны регулируют секрецию друг друга посредством паракринных межклеточных взаимодействий.

Поджелудочная железа может быть местом острых и хронических инфекций, опухолей и кист. Если его удалить хирургическим путем, жизнь можно поддерживать введением инсулина и сильнодействующих экстрактов поджелудочной железы. Приблизительно от 80 до 90 процентов поджелудочной железы можно удалить хирургическим путем, не вызывая дефицита эндокринных гормонов (инсулина и глюкагона) или экзокринных веществ (воды, бикарбоната и ферментов).

Гормональная регуляция энергетического обмена

Открытие инсулина в 1921 году стало одним из важнейших событий в современной медицине. Это спасло жизни бесчисленному количеству пациентов, страдающих сахарным диабетом, нарушением углеводного обмена, характеризующимся неспособностью организма вырабатывать инсулин или реагировать на него. Открытие инсулина также положило начало современному пониманию функции эндокринной поджелудочной железы. Значение эндокринной системы поджелудочной железы заключается в том, что инсулин играет центральную роль в регуляции энергетического обмена.Относительный или абсолютный дефицит инсулина приводит к сахарному диабету, который является основной причиной болезней и смертей во всем мире.

Гормон поджелудочной железы глюкагон в сочетании с инсулином также играет ключевую роль в поддержании гомеостаза глюкозы и в регулировании накопления питательных веществ. Адекватный запас глюкозы необходим для оптимального роста и развития организма, а также для функционирования центральной нервной системы, для которой глюкоза является основным источником энергии. Поэтому были разработаны сложные механизмы, обеспечивающие поддержание концентрации глюкозы в крови в узких пределах как во время еды, так и во время голода.Избыток потребляемых питательных веществ может храниться в организме и становиться доступным позже, например, когда питательных веществ не хватает, как во время голодания, или когда организм использует энергию, как во время физической активности. Жировая ткань является основным местом хранения питательных веществ, почти все в форме жира. В одном грамме жира содержится в два раза больше калорий, чем в одном грамме углеводов или белков. Кроме того, содержание воды в жировой ткани очень низкое (10 процентов). Таким образом, килограмм жировой ткани имеет в 10 раз большую калорийность, чем такой же вес мышечной ткани.

После приема пищи молекулы углеводов перевариваются и всасываются в виде глюкозы. Возникающее в результате увеличение концентрации глюкозы в крови сопровождается 5-10-кратным увеличением концентрации инсулина в сыворотке, что стимулирует поглощение глюкозы печенью, жировой и мышечной тканями и ингибирует высвобождение глюкозы из ткани печени. Жирные кислоты и аминокислоты, полученные в результате переваривания жира и белка, также поглощаются и накапливаются в печени и периферических тканях, особенно в жировой ткани.Инсулин также ингибирует липолиз (расщепление жира), предотвращая мобилизацию жира. Таким образом, во время «насыщения», или анаболического состояния, проглоченные питательные вещества, которые не используются немедленно, сохраняются, процесс, в значительной степени зависящий от связанного с пищей увеличения секреции инсулина.

Через несколько часов после еды, когда всасывание питательных веществ в кишечнике завершено, а концентрация глюкозы в крови снизилась до уровня, предшествующего приему пищи, секреция инсулина снижается, а выработка глюкозы печенью возобновляется для поддержания потребностей мозга. Точно так же увеличивается липолиз, обеспечивая жирные кислоты, которые могут использоваться в качестве топлива мышечной тканью, и глицерин, который может быть преобразован в глюкозу в печени. По мере увеличения периода голодания (например, с 12 до 14 часов) концентрация глюкозы в крови и секреция инсулина продолжают снижаться, а секреция глюкагона увеличивается. Увеличение секреции глюкагона и сопутствующее снижение секреции инсулина стимулируют расщепление гликогена с образованием глюкозы (гликогенолиз) и образование глюкозы из аминокислот и глицерина (глюконеогенез) в печени.После истощения запасов гликогена в печени концентрация глюкозы в крови поддерживается за счет глюконеогенеза. Таким образом, голодание, или катаболическое, состояние характеризуется сниженной секрецией инсулина, повышенной секрецией глюкагона и мобилизацией питательных веществ из запасов в печени, мышцах и жировой ткани.

При дальнейшем голодании скорость липолиза продолжает увеличиваться в течение нескольких дней, а затем стабилизируется. Большая часть жирных кислот, высвобождаемых из жировой ткани, превращается в кетокислоты (бета-гидроксимасляная кислота и ацетоуксусная кислота, также известные как кетоновые тела) в печени, процесс, который стимулируется глюкагоном.Эти кетокислоты представляют собой небольшие молекулы, содержащие два атома углерода. Мозг, который обычно использует глюкозу для получения энергии, начинает использовать кетокислоты в дополнение к глюкозе. В конце концов, более половины ежедневных метаболических потребностей мозга в энергии удовлетворяются за счет кетокислот, что существенно снижает потребность в производстве глюкозы печенью и потребность в глюконеогенезе в целом. Это снижает потребность в аминокислотах, образующихся при распаде мышц, тем самым щадя мышечную ткань. Голодание характеризуется низкими концентрациями инсулина в сыворотке, высокими концентрациями глюкагона в сыворотке и высокими концентрациями свободных жирных кислот и кетокислот в сыворотке.

Таким образом, в состоянии сытости инсулин стимулирует транспорт глюкозы в ткани (для потребления в качестве топлива или хранения в виде гликогена), транспорт аминокислот в ткани (для создания или замены белка) и транспорт жирных кислот. в ткани (чтобы обеспечить депо жира для будущих энергетических потребностей). В состоянии голодания секреция инсулина снижается, а секреция глюкагона увеличивается. Запасы гликогена в печени, а затем запасы белка и жира мобилизуются для производства глюкозы.В конечном счете, большая часть потребностей в питательных веществах обеспечивается жирными кислотами, мобилизованными из жировых запасов.

О раке поджелудочной железы | Исследование рака Великобритании

Поджелудочная железа – это железа, вырабатывающая пищеварительные соки и гормоны. Рак поджелудочной железы — это когда аномальные клетки в поджелудочной железе начинают делиться и расти неконтролируемым образом, образуя новообразование (опухоль).

Со временем клетки могут прорастать в окружающие кровеносные сосуды или органы, такие как тонкая кишка (двенадцатиперстная кишка).И раковые клетки могут распространиться на другие участки тела.

Поджелудочная железа

Поджелудочная железа является частью пищеварительной системы.

Поджелудочная железа находится довольно высоко в брюшке. Он лежит поперек вашего тела, где ваши ребра встречаются в нижней части грудины, сразу за животом. Это около 6 дюймов (15 сантиметров) в длину и по форме напоминает лист.

Поджелудочная железа состоит из 3 частей:

• широкий конец называется головкой
• тонкий конец называется хвостом
• часть посередине называется телом

Поджелудочная железа – это большая железа, которая вырабатывает пищеварительные соки и инсулин.Соки стекают по трубке (протоку поджелудочной железы) в двенадцатиперстную кишку. Двенадцатиперстная кишка — это первая часть тонкой кишки, соединенная с желудком.

Другая трубка (проток) впадает в двенадцатиперстную кишку. Желчный проток выходит из желчного пузыря и печени и соединяется с двенадцатиперстной кишкой рядом с протоком поджелудочной железы. Место, где два протока соединяются и встречаются с кишечником, называется фатеровой ампулой.

Поджелудочная железа представляет собой листовидный орган, расположенный под печенью, рядом с желчным пузырем, желудком и кишечником.

Является частью как пищеварительной, так и эндокринной систем.

Поджелудочная железа расположена поперек вашего тела сразу за желудком. Его длина составляет около 15 сантиметров.

Поджелудочная железа состоит из трех частей.

Широкий конец называется головкой.

Середина называется телом.

Тонкий конец называется хвостом.

Поджелудочная – большая железа. Он вырабатывает гормоны, которые регулируют уровень сахара в крови. Одним из таких гормонов является инсулин.Это эндокринная функция поджелудочной железы.

Поджелудочная железа также вырабатывает пищеварительные соки

Соки стекают по трубке, называемой протоком поджелудочной железы, в первую часть тонкой кишки.

Желчный проток соединяется с тонкой кишкой рядом с протоком поджелудочной железы.

Место, где два протока соединяются и встречаются с кишечником, называется фатеровой ампулой.

Пищеварительные соки содержат ферменты, помогающие расщеплять пищу в кишечнике.

Это называется экзокринной функцией поджелудочной железы.

Рак, который начинается в клетках, вырабатывающих пищеварительные соки, называется экзокринным раком поджелудочной железы. Это самый распространенный тип рака поджелудочной железы.

Рак, который начинается в клетках, вырабатывающих инсулин и другие гормоны, называется эндокринным раком поджелудочной железы или нейроэндокринными опухолями поджелудочной железы.

Рядом с поджелудочной железой находятся лимфатические узлы, которые являются частью нашей иммунной системы и помогают нам бороться с инфекциями.

Лимфатические узлы часто являются первым местом, куда попадают раковые клетки, отделяясь от опухоли.

Для получения информации о раке поджелудочной железы посетите сайт cruk.org/cancer-types

Что делает поджелудочная железа?

Поджелудочная железа вырабатывает пищеварительные соки и инсулин, а также другие гормоны, связанные с пищеварением.

Часть, вырабатывающая пищеварительные соки, называется экзокринной поджелудочной железой. Часть, которая вырабатывает гормоны, в том числе инсулин, называется эндокринной поджелудочной железой.

Рак, развивающийся из этих двух частей, может вести себя по-разному и вызывать разные симптомы.

Что делает пищеварительная система?

Пищеварительная система расщепляет и переваривает пищу. Примерно через 2 часа нахождения в желудке частично переваренная пища перемещается в начало двенадцатиперстной кишки.

Когда пища достигает двенадцатиперстной кишки, поджелудочная железа выделяет пищеварительные соки, которые стекают по протоку поджелудочной железы и смешиваются с пищей.

Соки содержат ферменты, которые помогают расщеплять пищу на очень мелкие фрагменты. Эти фрагменты всасываются в организм через тонкую кишку.

Поджелудочная железа и инсулин

Поджелудочная железа вырабатывает инсулин. Инсулин поддерживает уровень сахара в крови на стабильном уровне. Это означает, что клетки организма получают достаточно пищи, но не слишком много. Поджелудочная железа вырабатывает и выделяет больше инсулина, если уровень сахара в крови высок. Если уровень слишком низкий, он выпускает меньше.

У вас диабет, если вы не вырабатываете достаточно инсулина.

Насколько распространен рак поджелудочной железы?

Ежегодно в Великобритании рак поджелудочной железы диагностируется у 10 500 человек.Это 10-й наиболее распространенный вид рака в Великобритании.

Кто болеет раком поджелудочной железы?

Рак поджелудочной железы чаще встречается у пожилых людей. Более 45 из 100 человек с диагнозом (более 45%) – люди в возрасте 75 лет и старше. Рак поджелудочной железы редко встречается у людей моложе 40 лет.

В Англии рак поджелудочной железы чаще встречается у людей, живущих в более бедных районах. Это чаще встречается у белых и чернокожих, чем у азиатов.

Организация поджелудочной железы человека в норме и при диабете

У нормального здорового взрослого человека поджелудочная железа весит приблизительно 100 г, имеет длину от 14 до 25 см [1], объем приблизительно 72.4 ± 25,8 см ³ [2] и имеет как дольчатую, так и удлиненную форму (рассмотрено ранее [1]). Лежа косо позади задней и верхней брюшной стенки, этот сильно паренхиматозный орган делится на пять анатомических частей: головку, крючковидный отросток (находится в вентральной доле головы), шейку, тело и хвост (рис. 1). Нормальная поджелудочная железа человека растет примерно до 30 лет со значительной вариабельностью массы или объема поджелудочной железы у взрослых [2].

Основные анатомические особенности поджелудочной железы человека.( a ) Схема поджелудочной железы и окружающих органов. ( b ) Схематическое изображение организации эндокринной и экзокринной поджелудочной железы на клеточном уровне. ( c ) Островок поджелудочной железы человека, показывающий четыре типа эндокринных клеток. Масштабная линейка, 100 мкм. Этот рисунок доступен как часть загружаемого набора слайдов

Расположенный в верхней части живота, с головкой, непосредственно примыкающей к двенадцатиперстной кишке, область тела и хвоста поджелудочной железы простирается по средней линии тела до точки рядом с селезенкой.Точнее, головка лежит непосредственно напротив нисходящей и горизонтальной частей С-образной двенадцатиперстной кишки. Крючковатый отросток выступает вниз от головы и распространяется кзади по направлению к верхней брыжеечной артерии. Часть шейки простирается латерально от головки, где она соединяется с телом поджелудочной железы. Кзади от шеи находятся верхняя брыжеечная артерия и вена, а также место отхождения печеночной воротной вены. Аорта, верхняя брыжеечная артерия, левые почечные сосуды и левая почка расположены кзади от тела поджелудочной железы. Наконец, хвост находится в непосредственной близости от ворот селезенки. Эти анатомические параметры являются ключевыми для функции органа.

Подавляющее большинство тканей поджелудочной железы выполняет свою экзокринную функцию, при которой пищеварительные ферменты вырабатываются и секретируются через сложный проток в двенадцатиперстную кишку. Клетки поджелудочной железы, вырабатывающие эти пищеварительные ферменты, представляют собой ацинарные клетки, происходящие от латинского слова «ацинус», что означает «виноград», поскольку они представляют собой клеточные агрегаты, образующие пучки, похожие на грозди винограда (рис.1) [3]. Ацинарные клетки составляют почти 85% поджелудочной железы, расположены в ацинусах и синтезируют и секретируют ферменты, активные в переваривании белков, жиров и углеводов, включая трипсин, липазу и амилазу [4]. Каждый ацинарный пучок соединяется с системой протоков поджелудочной железы. Центроацинарные клетки представляют собой наиболее периферическую систему протоков и частично покрывают апикальную поверхность ацинарных клеток. Центроацинарные клетки соединяются с вставочными протоками, которые конвергируют и образуют внутридольковые и междольковые протоки, которые, в свою очередь, впадают в главный панкреатический проток.Главный проток, Вирсунгов проток, впадает в двенадцатиперстную кишку. Остаточная часть главного панкреатического протока, расположенная в дорсальной доле, так называемый проток Санторини, впадает в двенадцатиперстную кишку как добавочный панкреатический проток. Главный проток также соединяется с желчным протоком в головке поджелудочной железы, образуя гепатопанкреатический проток (то есть фатерову ампулу). Поток через фатерову ампулу контролируется мышечным сфинктером Одди, открывающимся во время пищеварения и закрывающимся для предотвращения рефлюкса содержимого двенадцатиперстной кишки в дерево протоков поджелудочной железы после приема пищи.

Ацинарные ферменты секретируются в богатую бикарбонатом жидкость, вырабатываемую эпителием протоков. Секреция поджелудочной железы происходит с низкой скоростью между приемами пищи (0,2–0,3 мл/мин) и заметно увеличивается во время еды (4,0 мл/мин) до общего суточного объема ~2,5 л [5]. Выделение жидкости поджелудочной железы регулируется несколькими гормонами, а также вегетативной нервной системой. Когда пища попадает в двенадцатиперстную кишку, энтероэндокринные клетки, обнаруженные в слизистой оболочке, выделяют гормоны (например, секретин, холецистокинин) в кровоток, которые, в свою очередь, стимулируют поджелудочную железу к выработке и выделению большого количества воды, бикарбонатов и пищеварительных ферментов (например, секретин, холецистокинин).например, амилаза и липаза) и зимогены (например, трипсиноген, химотрипсиноген, проэластаза и прокарбоксипептидаза), которые являются неактивными предшественниками ферментов, которые активируются протеолитическими ферментами после их секреции. Эти ферменты играют решающую роль в переваривании пищи, поступающей в тонкую кишку из желудка.

Между скоплениями ацинарных клеток расположены рассеянные участки эндокринной секреторной ткани, известные как островки Лангерганса. Приблизительно один миллион этих микроорганизмов [6] существует в поджелудочной железе, общий вес которых составляет около 1 г и составляет 1–2% от общей массы поджелудочной железы [6]. При развитии поджелудочной железы человека островки возникают из компартмента энтодермальной ткани и наблюдаются в вентральной и дорсальной долях. У человека примерно 40–60% эндокринных клеток представляют собой бета-клетки, продуцирующие инсулин, а остальные представляют собой альфа-, дельта-клетки, панкреатический полипептид (PP; также известный как F) и эпсилон-клетки (рис. 1), которые секретируют глюкагон. соматостатин, панкреатический полипептид и грелин соответственно. Однако пропорция этих различных типов эндокринных клеток внутри островка варьируется в зависимости от размера островка, возраста и расположения в органе (обзор ранее [7, 8]).Меньшие островки состоят в основном из бета-клеток, в то время как более крупные островки могут иметь почти одинаковое количество бета- и альфа-клеток [7, 8]. Островки, происходящие из вентральной доли, содержат области, богатые PP-клетками, с небольшим количеством бета- и альфа-клеток, которые обнаруживаются исключительно в задней головке и крючковидных областях поджелудочной железы [9].

Каждый островок кровоснабжается одной или несколькими небольшими артериями (артериолами), которые разветвляются на многочисленные капилляры. Эти капилляры появляются и сливаются в мелкие вены за пределами островка.Что касается иннервации поджелудочной железы, двигательные нервные волокна несут импульсы как к ацинарным клеткам, так и к панкреатическим островкам [10, 11]. Парасимпатические волокна индуцируют секрецию ацинарных клеток, что в конечном итоге приводит к выделению панкреатического сока, а также к стимуляции островков к секреции инсулина, глюкагона и других полипептидных гормонов, необходимых для нормальной регуляции уровня глюкозы в крови. Напротив, симпатические волокна вызывают ингибирование экзокринной и эндокринной секреции (ранее рассмотрено [12]). Таким образом, функции островков регулируются сигналами, инициируемыми вегетативными нервами, циркулирующими метаболитами (напр.г., глюкоза, аминокислоты и кетоновые тела), циркулирующие гормоны и местные (паракринные) гормоны.

Стереологический анализ всей поджелудочной железы человека

Крупномасштабный захват изображения и компьютерный полуавтоматический анализ среза всей ткани

Использовались доноры с диабетом (nPOD) (№ 6107 Хвост 02, самец 2,2 года, не страдающий диабетом; рис. 1). Во-первых, весь срез ткани захватывается модифицированным методом «захвата изображения виртуального среза» с использованием 10-кратного объектива ^23,24 .Изображение одного виртуального среза обычно состоит из нескольких сотен оптических панелей. Каждый виртуальный срез, полученный на нескольких флуоресцентных каналах, объединяется в один композит (рис. 1А). Захват изображения виртуального среза показан на дополнительном рисунке 1Aa.

( A ) Виртуальный срез среза поджелудочной железы человека (самка, 2,2 года, не страдающий диабетом; nPOD # 6107 Tail 02), иммуноокрашенный на инсулин (зеленый), глюкагон (красный), соматостатин (белый) и ядра (синие). Серия смежных оптических панелей образца собирается и объединяется в единый монтаж изображения. Композит создается путем слияния четырех перекрывающихся изображений виртуальных срезов. ( B ) Изображения каждого канала, показывающие клеточный состав кластера островков из виртуального среза в ( A ). ( а) Бета-клетки. ( б) Альфа-клетки. ( c) Дельта-клетки. ( г) Ядра. ( e) Состав всех трех эндокринных клеток и ядер. ( f) Общая площадь эндокринных клеток показана как преобразованная 8-битная маска после автоматического порогового значения.( г) Ядра эндокринных клеток. (h) Общая площадь островков, включая неокрашенные фракции, такие как внутриостровковые капилляры. Обратите внимание, что каждому островку, включая небольшие кластеры, присваивается идентификационный номер. Таблица, обобщающая данные, полученные в результате компьютерного крупномасштабного анализа.

Первым этапом обработки изображения является «вычитание фона с катящимся шаром» для удаления больших пространственных вариаций интенсивности фона, которое применяется ко всем полученным изображениям на 4 каналах в целом (т. е. нет выбора региона). На S.1A.b показано окрашенное DAPI изображение после вычитания фона. Для точного количественного определения массы эндокринных клеток наиболее важным шагом в нашем методе является определение области поджелудочной железы, к которой нормализуется масса эндокринных клеток. Для анализа всего среза ткани важно учитывать структурную изменчивость всей поджелудочной железы. Например, в срезах ткани поджелудочной железы человека большие площади сосудов могут занимать >20% всего среза.Это будет смешивать правильную нормализацию с согласованностью и последующим анализом любых типов сравнений, например, между пострадавшими и контрольными, а также между каждой группой. Здесь мы вручную контурируем «область поджелудочной железы» до нормализованной, исключая области, которые не содержат эндокринных клеток/островков или экзокринных клеток и занимают> 0,05% данного участка (S.1B), такие как крупные кровеносные сосуды и протоки, периферия. накопленная внутрипанкреатическая жировая ткань (которая часто наблюдается у лиц с ожирением и пожилых людей) и пустое пространство между долями экзокринной части поджелудочной железы (которое в некоторых случаях может быть результатом подготовки ткани). Изображение DAPI используется для рисования контура, как показано в S.1A.c. Комбинация из 4 каналов используется в качестве эталона для определения эндокринных клеток/островков и «области поджелудочной железы». Контур можно нарисовать с помощью компьютерной мыши или графического планшета, что облегчает работу, а также повышает точность. После оконтуривания исключаются области вне контура (S.1A.d). Этот контур затем применяется к другим трем каналам, чтобы убедиться, что анализируется та же область, как показано на S.1A.e–g. Набор из четырех каналов может быть объединен в единое составное изображение RGB с тремя типами эндокринных клеток и ядрами разных цветов для визуальной ясности (S.1А.з). Изображения подготавливаются к анализу с использованием «Макроса обработки изображений» (S.2), а затем «Макрос анализа изображений» (S.3) использует обработанные изображения для количественного анализа. Макрос представляет собой специально написанный сценарий, основанный на функциях Fiji/Imagej и предоставляющий инструкции для количественной оценки интереса в каждом приложении. «Макрос обработки изображений» помогает вручную установить пороговые значения для всех четырех каналов, которые будут сохранены в виде текстового файла. Обработанные изображения будут сохранены вместе в одной папке с определенными именами файлов.Затем «Макрос анализа изображений» использует файлы в папке для количественной оценки клеточного состава (т.е. популяций и ядер бета-, альфа- и дельта-клеток; рис. 1Ba-d). Композиция всех трех эндокринных клеток и ядер показана на рис. 1Be. Общая площадь эндокринных клеток измеряется с использованием преобразованных 8-битных изображений (оттенки серого между черным и белым) после автоматического определения порога (рис. 1Bf). Для последующего количественного определения добавляется область ядра каждой эндокринной клетки внутри островков (рис. 1Bg). Общая площадь островков, включающая неокрашенные фракции, такие как внутриостровковые капилляры, измеряется путем автоматического контурирования каждой структуры островков (рис.1Вч). Каждому островку, включая небольшие кластеры, присваивается идентификационный номер, чтобы можно было получить конкретную информацию об отдельных островках, как показано в таблице.

Настройка лабораторного компьютера имеет решающее значение, так как многоканальные изображения большого размера, полученные с помощью микроскопа, требуют высокопроизводительной системы передачи, хранения и поиска. Рекомендуется использовать проводную сеть Ethernet с сервером (серверами) и емкостью хранения более 30 терабайт, поскольку это облегчает передачу, поиск и обработку изображений и данных.Компьютерная система на базе Linux, работающая на сервере, оснащенном многоядерным процессором, 32 ГБ памяти и дополнительным пространством подкачки памяти, оптимальна для запуска «Макроса анализа изображений» на больших файлах изображений. Fuji/ImageJ совместим с Windows и Mac OS X, однако рабочая среда Linux удобна для пакетной обработки, работы в сети, запланированных процедур, массива независимых дисков с программным резервированием (RAID) для резервного копирования и доступа к инструментам командной строки с открытым исходным кодом, полезным для сжатие и преобразование между большими форматами файлов изображений. На практике изображения загружаются на сервер вечером, что позволяет проводить автоматический анализ ночью.

Измерения пространственного распределения островков и каждого типа эндокринных клеток в пределах островка

Пространственное распределение островков в срезе ткани можно исследовать путем измерения центроида каждого островка (рис. 2Аа) с использованием «Макроса анализа изображений». Для дальнейшего анализа архитектуры островков измеряются центральные координаты каждого типа эндокринных клеток внутри островков.Реконструированное распределение эндокринных клеток в каждом островке показано на рис. 2Ab (бета-клетки выделены зеленым цветом, альфа-клетки выделены красным цветом и дельта-клетки выделены синим цветом). Координатные данные используются для подсчета количества эндокринных клеток каждого типа в островках и для дальнейшего анализа клеточного состава и географической архитектуры островков (например, для математического моделирования ^{25,26,27,28,29} ). Последовательный анализ с помощью макроса анализа изображений показан на рис. 2B с использованием одного островка в качестве примера. Сначала флуоресцентные сигналы DAPI преобразуются в 8-битные изображения.Затем применяется сегментация водораздела для определения каждой границы ядра (рис. 2Ba). После идентификации каждого ядра каждому из них присваивается определенный идентификационный номер, соответствующий индивидуальным пространственным координатам ядер (рис. 2Бб). Увеличенный вид на рис. 2Bc показывает определенный периметр каждого ядра (желтая линия) с его собственным идентификационным номером. Затем все идентифицированные периметры ядра накладываются на сигналы трех гормонов, чтобы определить, какое ядро ​​относится к какому конкретному типу клеток (рис.2Bd–f, бета-, альфа- и дельта-клетки соответственно). Автоматическая идентификация каждого типа клеток проиллюстрирована на рис. 2C на уровне одной ячейки с использованием бета-клетки в качестве примера. Для каждого идентифицированного ядра (обведенного желтой линией) периметр ядра расширяется на 1 пиксель (~ 1  мкм), чтобы обнаружить цитоплазматическую область, непосредственно окружающую ядро, которая используется для определения соответствующего типа клеток. Здесь это автоматическое расширение может ошибочно включать сигналы от других типов клеток из-за непосредственной близости каждого типа эндокринных клеток в пределах данного островка.Таким образом, макрос анализа изображений предназначен для определения наиболее распространенных сигналов, чтобы различать определенный тип клеток (S.3). Видеозапись компьютерного анализа размещена в Интернете (Видео 1). Схематический обзор рабочего процесса показан на рис. 3.

( Aa ) Примеры измеренных центроидов островков и небольших скоплений. ( b) Реконструированное распределение эндокринных клеток в пределах каждого островка (бета-клетки выделены зеленым, альфа-клетки выделены красным и дельта-клетки выделены синим цветом).( B ) Последовательный анализ с помощью макроса анализа изображений. ( a) Сегментация водораздела применяется к 8-битному изображению, преобразованному из флуоресцентных сигналов DAPI. ( b) Ядрам присвоен каждый конкретный идентификационный номер, соответствующий индивидуальным пространственным координатам ядер. ( c) Увеличенный вид, показывающий определенный периметр каждого ядра (желтая линия) с его собственным идентификационным номером. ( г) Бета-клетки. ( e) Альфа-клетки.( f) Дельта-ячейки. ( C ) Автоматическая идентификация каждого типа клеток. В качестве примера показан случай одиночной бета-клетки. Периметр идентифицированного ядра (обведен желтой линией) увеличивается на 1 пиксель (~ 1  мкм), чтобы обнаружить цитоплазматическую область, непосредственно окружающую ядро, которая определит его конкретный тип клетки.

Начиная с мультифлуоресцентной иммуногистохимии, 4-канальная визуализация выполняется в режиме виртуальных срезов на микроскопе.Захваченные изображения (каждое по 1–2 ГБ) сначала передаются на Сервер (например, с объемом хранилища 30 ТБ. Обратите внимание, что Сервер служит как для обработки изображений, так и для хранения больших наборов данных). Обработанные изображения загружаются на рабочую станцию ​​для последующего анализа изображения. Наша схема маркировки обработанных изображений показана справа вместе с приблизительным временем обработки на каждом этапе. Во-первых, «Вычитание фона» применяется ко всем изображениям каналов с использованием Fiji/ImageJ. На изображении DAPI «область поджелудочной железы» контурируется вручную и сохраняется как файл «.файл roi. Определенная площадь поджелудочной железы применяется к изображениям, для которых был вычтен фон («BS.**.tif»), и полученные файлы изображений сохраняются как «Cropped.**.tif». Затем, запустив «Макрос обработки изображения», вручную установите порог оптимальной интенсивности в оттенках серого, следуя инструкции, заложенной в макросе. Макрос автоматически создает набор файлов изображений, готовых для количественного определения. Эти файлы в папке «Final» вручную загружаются на сервер для количественного определения различных параметров. Запустите «Макрос анализа изображений», и файлы Excel будут автоматически созданы, содержащие результаты с выбранными параметрами. В нижней части перечислены примеры различных анализов со ссылкой на каждый рисунок, показанный в настоящем исследовании.

Моделирование для изучения возможной систематической ошибки выборки, возникающей в результате выбора областей, богатых островками и, кроме того, считается, что среднее значение трех повторов (или более) данного блока ткани представляет общую площадь/массу эндокринных клеток.

Для первого моделирования мы выбрали крайний случай, который содержит как богатые, так и бедные PP-клетками области в области головки поджелудочной железы человека (рис. 4А). Здесь мы стремимся показать, как выбор конкретных областей приводит к неточной количественной оценке. Мы начали с наиболее богатой PP-клетками области (красный прямоугольник на рис. 4Aa) с предположением, что любой исследователь будет искать скопление крупных эндокринных клеток/островков и пытаться захватить как можно больше внутри оптической панели, чтобы получить значимые данные. Начиная с области, наиболее богатой РР-клетками, систематически добавлялись другие панели, богатые РР-клетками, в конечном итоге добавляя области, не богатые РР-клетками, количество островков уменьшалось до тех пор, пока все островки не были учтены, в общей сложности до 153 панелей (выбранные оптические панели выделены желтым цветом и пронумерованы последовательно). Каждую панель анализировали на площадь эндокринных клеток и делили на общую площадь поджелудочной железы, чтобы получить процент площади эндокринных клеток. Полоса, отмеченная звездочкой, представляет собой фактическую среднюю площадь эндокринных клеток с использованием нашего метода крупномасштабного количественного определения.Эти результаты предполагают, что выбор областей, богатых островками, может завышать массу эндокринных клеток в 3-10 раз. Это завышение происходит из-за недостаточной нормализации, где «площадь поджелудочной железы» в нашем количественном анализе состояла из 556 оптических панелей, а не из 153, как максимум. ткань, потому что одно и то же смещение выборки будет перенесено на каждый раздел.

( A ) Моделирование 1 с использованием среза ткани поджелудочной железы из области головки, который содержит области, богатые и бедные PP-клетками. ( a) Область поджелудочной железы выделена голубым цветом. Область, богатая РР-клетками, обведена желтым цветом. Врезка: первая область в рамке, снятая с помощью объектива с 10-кратным увеличением, показана красным. Оптические панели были последовательно выбраны, как указано в желтых прямоугольниках. ( b) Выбранные панели систематически добавлялись до 153 панелей.( c ) На график наносится кумулятивное среднее значение каждого количественного определения. Звездочка изображает значение, полученное в результате нашей крупномасштабной количественной оценки. ( B ) Измерение площади эндокринных клеток на каждом 50 ^-м -м срезе в пределах блока. ( a) Анализ области эндокринных клеток всей поджелудочной железы (т.е. PP, бета- и альфа-клеток) от головки, тела до области хвоста (слева направо). ( b) Блок № 4 был выбран, потому что он показал ту же массу эндокринных клеток, что и блок № 6.Весь блок № 4 был нарезан толщиной 5 мкм, что дало более 300 секций. Общая площадь эндокринных клеток измерялась в каждом 50 срезах с применением нашего крупномасштабного анализа. ( C) Моделирование 2 с использованием образца nPOD, показанного на рис. 1. ( a) Для проверки обычно используемого выбора областей, богатых островками, были последовательно выбраны оптические панели, до 30 панелей, как указано в желтых прямоугольниках. Обратите внимание, что каждая область оптической панели эквивалентна использованию 20-кратного объектива.( b) Диапазон завышения в результате выборки показан по сравнению с крупномасштабным анализом.

Затем мы проверили возможную изменчивость в пределах одного блока ткани (рис. 4В). Мы вырезали целый блок № 4 толщиной 5 мкм, что дало более 300 секций. Мы проверили каждый 50-й ^-й -й раздел, применяя наш метод. Обоснование выбора блока № 4 заключается в том, что один срез из блока № 4 и блока № 6 дал аналогичные значения массы каждой эндокринной клетки.В нашем препарате эти две секции находились друг от друга на расстоянии ~ 1  см. По сравнению с вариабельностью общей площади эндокринных клеток в пределах всей поджелудочной железы в пределах 0,15–3,0% (рис. 4Ва), различия в массе эндокринных клеток на 6 срезах, исследованных в пределах блока, находились в диапазоне 0,03–0,12% (рис. 4, а). Рис. 4Бб). Таким образом, один раздел на блок обеспечивает репрезентативную количественную оценку, когда измеряется весь раздел.

Использование образца nPOD в области хвоста (т. е. без области, богатой PP-клетками) с окрашиванием тремя основными гормонами (т.е. инсулин, глюкагон и соматостатин), показанные на рис. 1, мы попытались воспроизвести общий метод выбора нескольких областей из одного среза, начав с области, наиболее богатой островками (рис. 4Ca). Согласно большинству применений, описанных в опубликованных статьях, оптические панели последовательно отбирали до 30 панелей, площадь каждой из которых была эквивалентна площади при использовании объектива с 20-кратным увеличением, как указано в желтых прямоугольниках. Средние значения массы эндокринных клеток при выборе от 5 до 30 оптических панелей представлены на рис.4сб. По сравнению с анализом всего среза, который включает 146 оптических панелей, результирующая оценка завышена от 4,5 до 8 раз.

Сравнение с широко используемой морфометрией с подсчетом точек

Морфометрия с подсчетом точек на сегодняшний день является наиболее широко используемым методом количественного определения массы бета-клеток в поджелудочной железе. На фигуре 5А показан пример сравнения с использованием панели в оттенках серого инсулин-позитивных бета-клеток. Подсчет точек представляет собой регулярную квадратную сетку с интервалом между вершинами ~25 мкм, показанную белыми точками на наложенном изображении. Желтые контуры вокруг бета-клеток показывают степень классифицированной массы бета-клеток. Вершины, зарегистрированные как положительные, выделены зеленым цветом. Общая площадь бета-клеток измеряется как отношение положительных к отрицательным вершинам сетки (всего 945 точек). На этой панели было подсчитано 30 точек, что дало массу бета-клеток 3,18%, тогда как по нашему методу она количественно определяется как 1,54%.

(A ) Пример сравнения с использованием панели инсулин-положительных бета-клеток в градациях серого, наложенной на обычную квадратную сетку с интервалом между вершинами 25 мкм.Степень классифицированной массы бета-клеток обведена желтым цветом. Вершины, зарегистрированные как положительные, выделены зеленым цветом. ( B ) Моделирование с использованием одного и того же среза ткани поджелудочной железы из области головки, которая содержит области, богатые и бедные PP-клетками, показанные на рис. 2A. ( C) Сравнение в каждой оптической панели. Различия нормализованы к измерению нашего метода и показаны в виде соотношения. Заниженные значения показаны красными полосами. ( D) Репрезентативный вид панелей, которые привели к недооценке.( E) Пример количественного определения в островках мыши и человека при применении морфометрии с подсчетом точек.

Затем мы провели в основном такое же моделирование, как описано на рис. 4A, B, но с использованием морфометрии с подсчетом точек. В результате диапазон переоценки заметно увеличился аддитивно по сравнению с выбором областей, богатых островками, в диапазоне от 4 до 14 раз (рис. 5B). Сравнение в каждой оптической панели показывает, что это завышение происходит в большинстве из них (рис. 5C).Недооценка на некоторых панелях (красные столбцы на рис. 5С) происходит, когда панель содержит единично разбросанные эндокринные клетки, которые часто попадают между точками (рис. 5D). Общая заметная завышенная оценка может быть также связана с уникальной архитектурой островков человека по сравнению с островками грызунов, которые имеют ядро ​​​​бета-клеток. Рисунок 5E иллюстрирует возможную степень переоценки морфометрии подсчета точек между островками мыши и человека (30,4% против 22,3% и 19,3% против 7,4% соответственно).

Распределение островков по размерам и клеточный состав

Используя вычислительную платформу, такую ​​как MATLAB или Mathematica, можно выполнять различные целевые анализы на основе крупномасштабных наборов данных, полученных с помощью анализа изображений Fiji/Image J, как описано выше.Размеры островков находятся в широком диапазоне от одной эндокринной клетки до большого островка, состоящего из нескольких тысяч клеток. Кроме того, чаще встречаются более мелкие островки (включая одиночные клетки и небольшие скопления). Традиционно такой анализ проводился путем группирования островков по размеру как малых, средних и больших, и результаты суммировались по каждой категории. Наша цель — зафиксировать динамическое изменение клеточного состава по всему широкому распределению размеров островков (рис. 6А). Здесь мы использовали логарифмическую шкалу размера для гистограммы размеров островков, потому что она дает мелкие ячейки для большого количества маленьких островков и большие ячейки для небольшого количества больших островков. Это обеспечивает не только четкие категории размеров малых островков, но и статистически адекватное количество островков в бинах большого размера. В области головы (nPOD # 6107, возраст 2,2 года) бета-клетки составляют ~ 80% по всему распределению по размерам, тогда как доля альфа-клеток увеличивается в области тела и хвоста.

Были проанализированы образцы из области головы, тела и хвоста nPOD #6107. ( A) Частота размеров островков (серая полоса) и соотношение бета-клеток (зеленый), альфа-клеток (красный) и дельта-клеток (синий) в островках нанесены на график в зависимости от размера островков; означает ± SEM.Обратите внимание, что размер островков представлен в виде логарифмической шкалы с учетом большого количества маленьких островков и небольшого количества больших островков. Кроме того, площадь островка делится на площадь одной клетки (178 мкм ^{2 31} ), чтобы сделать их безразмерными значениями, представляющими количество клеток в данной области островка. См. преобразование между логарифмической площадью островка (логарифмическая) и эффективным диаметром (мкм). ( B) Доля распределения размеров островков (серая полоса) и общая площадь островков (красная линия).( C) Трехмерная визуализация распределения островков по размеру и форме. Каждая точка представляет собой отдельный островок/кластер в отношении размера (площади) и формы (округлости и диаметра Ферета). Плотность островков имеет цветовую кодировку от разреженной до плотной. ( D) Трехмерные диаграммы рассеяния, выделяющие островки, содержащие РР.

На рис. 6В показан относительный вклад каждой ячейки малых и больших островков в общую площадь эндокринных клеток. Большее количество эндокринных скоплений и небольших островков (серые столбцы) не имеет заметной доли общей площади (отмечено красной линией), но меньшее количество крупных островков в основном составляет массу островков.

Дополнительными параметрами, которые мы измеряем, являются округлость и диаметр Ферета каждой островковой структуры. Округлость сообщает о степени округлости конструкции, где 1,0 соответствует идеальному кругу. Диаметр Ферета — это самое длинное расстояние внутри конструкции. Круглость и диаметр Фере тесно связаны между собой и вместе изображают форму данной структуры ²¹ . При таких параметрах площади, диаметра Ферета и округлости все распределение эндокринных клеток и островков во всем образце можно визуализировать на трехмерной диаграмме рассеяния (рис.6С). Цветовое кодирование сообщает о плотности кластера аналогичного размера и формы. Большое количество синглетов и небольших скоплений эндокринных клеток плотно сгруппированы в нижней части трехмерной диаграммы рассеяния. Небольшое количество крупных островков показано как одиночные рассеянные (т.е. красные точки) с различными размерами и формами от сферической до удлиненной структуры.

Трехмерная диаграмма рассеяния, показанная на рис. 6D, предназначена для визуализации регионального распределения определенного типа клеток, в данном случае PP-клеток, содержащих островки, отмеченные красным. Можно визуально продемонстрировать значительную сегрегацию PP-клеток в области головы в отличие от значительно меньшего количества PP-клеток в области тела и хвоста.

Пользовательские сценарии для этих анализов представлены в S.2–7.

Индивидуальная неоднородность массы бета-клеток/эндокринных клеток

Анализ поджелудочной железы в целом выявил заметную индивидуальную вариабельность (т.е. региональные различия), а также индивидуальную неоднородность массы бета-клеток/островков. На рисунке 7 показаны 10 случаев анализа всей поджелудочной железы от головки, тела до области хвоста.Все графики построены в одном масштабе для лучшего сравнения. В целом региональное распределение массы бета-клеток/островков показывает постепенное увеличение от головы к хвосту, хотя оно заметно колеблется. Прямой корреляции между возрастом и полом не наблюдается. Лица с ожирением, не страдающие диабетом В и большинство больных СД2, кроме I, не отличаются от лиц с нормальным весом. Неоднородность среди пациентов с СД2 и дальнейшее сравнение с недиабетическими субъектами поразительны.

(A–E) лица, не страдающие диабетом. (F–J) пациента с СД2. Ось X: номер блока от головы, тела до области хвоста (слева направо).

Возможная систематическая ошибка при оценке общей массы эндокринных клеток у отдельных лиц путем выбора конкретного блока ткани поджелудочной железы из всей поджелудочной железы человека . Здесь мы рассмотрели, в какие диапазоны «оценочная масса островков» может отклоняться в зависимости от отбора, используя 10 случаев, показанных на рис.8. Граница области головы была анатомически определена на шее, а оставшаяся часть была разделена пополам на области тела и хвоста (например, рис. 8А; случай F). Наша схема моделирования должна была охватывать каждый возможный выбор. Результаты смоделированного анализа каждого отдельного случая приведены в таблице S1. Затем мы объединили все эти результаты из 10 случаев и исследовали диапазон между максимальной и минимальной завышенной оценкой, полученной в результате 5 различных методов отбора, по сравнению с анализом всей поджелудочной железы (точечные диаграммы на рис.

(А) Схема отбора проб. Границу головной области анатомически определяли на шее, а оставшуюся часть делили пополам на туловищную и хвостовую области.( B) Многократные изменения массы островковых клеток при 5 типах моделирования по сравнению с анализом всей поджелудочной железы. ( C) Увеличение соотношения островковых клеток (т.е. бета/альфа, бета-дельта и альфа/дельта клеток) при выборе 100 крупных островков по сравнению с анализом всей поджелудочной железы.

С появлением представления о преобразовании не-бета-клеток в бета-клетки ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10} возможны изменения соотношения бета:альфа:дельта-клеток часто измеряется путем выбора определенного количества островков в данном срезе ткани. Здесь мы систематически отбирали 100 островков, начиная с самого большого, в каждом срезе/блоке во всех 10 случаях и сравнивали с анализом всей ткани поджелудочной железы (рис. 8С). Среднее общее количество островков на секцию в этом исследовании было > 500, таким образом, самые большие 100 островков составляют примерно 20% от общего числа островков на секцию. Общая тенденция к недооценке соотношения бета/альфа-клеток предполагает переоценку числа альфа-клеток, поскольку соотношение альфа-клеток внутри островка увеличивается с размером островка у человека ²¹ .Обратите внимание, что эта внутренняя зависящая от размера изменчивость островков человека может способствовать неточному представлению соотношения клеток, даже когда анализируется достаточно большое количество 100 островков. В качестве крайнего сравнения мы также изучили соотношение альфа/дельта клеток. Когда обе популяции значительно меньше, чем у бета-клеток, отбор заметно влияет на точность измерений.

Трехмерная карта маршрутов островков в поджелудочной железе здорового человека

В этом исследовании поджелудочная железа здорового человека от донора использовалась для оценки характеристик островков и их пространственного распределения. Первоначально первые измеряемые параметры состояли из длины ( 25 см ) и объема ( 45 см ³ ). Далее были приняты во внимание четыре области поджелудочной железы, а именно головка (обозначенная как B1), шейка (B2), тело (B3) и хвост (B4). Из каждого среза поджелудочной железы мы использовали один репрезентативный поперечный срез, который был разделен на 16 гистологических слайдов. На каждом предметном стекле проводили полуавтоматические морфометрические измерения с целью выявления особенностей панкреатических островков.Мы проанализировали в общей сложности 5423 островков , принадлежащих к четырем интересующим отделам, а именно головке (910 островков), шейке (813 островков), телу (2057 островков) и хвосту (1643 островков) поджелудочной железы (таблица 1). . В таблице 1 показано количество обнаруженных островков для каждого гистологического предметного стекла (B1[P1–P16]–B4[P1–P16]). Максимальное количество островков, обнаруженных на предметном стекле, было обнаружено в срезе тела поджелудочной железы (233 островка), а именно на предметном стекле B3[P5], тогда как минимальное количество островков было обнаружено в срезе шейки на предметном стекле B2[P4]. горка.С точки зрения продольной перспективы срезов поджелудочной железы (общее количество островков, обнаруженных во всех срезах на предметных стеклах B1–4[Px]), максимальное количество островков было обнаружено на предметных стеклах B1–4[P15] (473 островка), а минимальное количество островков на предметных стеклах B1–4[P12], всего 156 островков (таблица 1). Анализ морфометрических измерений показал, что общая площадь 2D островков составляет на каждом срезе (таблица 2). Таким образом, 16 гистологических препаратов среза головы (B1) показали общую площадь островков из 9.252 мм мм ² и средний островной площадью 0,578 мм ² (± 0,467), в то время как шейный ломтик (B2) показал Total Islet площадь 6,960 мм 2 и средняя площадь островков 0,435 мм ² (±0,359). Срезы тела и хвоста показывают наибольшее покрытие поверхности (таблица 2). 16 гистологических препаратов среза тела (B3) показали общую площадь островков (и среднюю площадь островков) 14,004 мм ² (среднее 0. 875 мм ² ±0,391), которые были аналогичны общей площади островков, обнаруженной в срезе хвоста (B4), а именно 14,186 мм ² (в среднем 0,887 мм ^{2,6330 ±0. Интересно, что хотя два среза (B3 и B4) показывают одинаковые значения общей площади островков, они показывают различное распределение островков на поверхности двух срезов (рис. 1А). С точки зрения 2D общая площадь островков на всех ( 64 предметных стеклах ) гистологических предметных стеклах показывает значение приблизительно 44.4 мм 2 (44 401 127,94 мкм 2 ) со средней площадью 2,775 мм 2 (±0,467) и средней площадью островков на предметном стекле 0,694 мм 2 (таблица ±} ). Подробное сравнение площади островка и периметра островка показывает относительные различия в пропорциях между двумя морфометрическими параметрами (дополнительная таблица S1 онлайн). Кроме того, было проведено численное распределение между средней площадью и количеством островков для каждого предметного стекла микроскопа (дополнительная таблица S2 онлайн). На следующем этапе нас интересовало определение ряда параметров, а именно диаметра островков, среднего объема островков, общего количества островков внутри поджелудочной железы, общего объема, занимаемого островками внутри поджелудочной железы, и общей трехмерной поверхности островков. .

Распределение панкреатических островков.

( A ) двухмерное распределение панкреатических островков на каждом участке (B1–B4) поджелудочной железы. Также представлены поджелудочная железа от донора и схема организации срезов. Дорсальная часть поджелудочной железы представлена ​​слайдами Bx[P1-P4], тогда как вентральная часть поджелудочной железы представлена ​​слайдами Bx[P13–P16]. ( B ) доля островков вдоль четырех секций. Распределение островков поджелудочной железы на каждом гистологическом препарате в зависимости от количества островков и их средней площади (мкм ² ) показано для: ( C ) области головки (B1), ( D ) области перешейка (B2 ), ( E ) область тела (B3), ( F ) область хвоста (B4).Средняя площадь поверхности (мкм ² ) островков представлена ​​на оси X, тогда как количество островков представлено на оси Y. Количество островков и их средняя площадь на срез (В1–В4) приведены для: ( J ) области головы (B1), ( I ) области перешейка (B2), ( G ) области тела ( B3), ( H ) хвостовая часть (B4). Линии тренда на панелях с C по H используют полином третьего порядка. ( K ) распределение островков, упорядоченное по размеру.Для каждого среза (B1–4) количество островков представлено по оси X, тогда как площадь поверхности (мкм ² ) островков представлена ​​по оси Y. Точки в форме ромба представляют собой островки в области головы. Точки квадратной формы представляют собой островки в области шеи, а точки треугольной формы представляют собой островки в области тела. Точки круглой формы представляют собой островки в области хвоста. ( L ) глобальное распределение 5423 островков в зависимости от их периметра и площади.Пунктирная линия тренда панели L использует полиномиальный порядок 4. Прямая пунктирная линия и стрелки в полукруге на панели K и L представляют собой барьер, над которым наблюдались скопления островков.

Диаметр островка

Для расчета среднего значения диаметра островка использовались два метода из-за различных форм наблюдаемых островков, которые создают относительную непропорциональность между их площадью и их периметром (т.е.островок в форме звезды будет иметь непропорциональный периметр от площади поверхности, а островок круглой формы будет показывать пропорциональность между периметром и площадью поверхности). Первый метод учитывал средний периметр ( p _м ) островков, измеренный на гистологическом предметном стекле, и рассчитывали средний диаметр островков (1). Таким образом, было обнаружено, что средний диаметр островков (диаметр островков по периметру — d _ip ) всей поджелудочной железы имеет значение 113.83 мкм (±7,05). Второй метод, используемый для расчета диаметра панкреатических островков, учитывает их измеренную площадь поверхности ( a _м ) по гистологическому предметному стеклу, а средний диаметр островка рассчитывают по формуле (2). Таким образом, с помощью этой второй версии формулы было обнаружено, что средний диаметр островков (диаметр островков с использованием площади — d _ia ) всей поджелудочной железы имеет значение 104,02 мкм (± 5,0.67). Путем усреднения двух результатов мы рассчитали средний диаметр (средний диаметр — d _м ) между двумя значениями (3), который считается более близким к фактическому среднему значению диаметра островка. Радиус (средний радиус островка — r _i ) также был определен (4). Таким образом, средний диаметр островка ( d _м ) между двумя методами оценки составил 108,92  мкм (±6.27) с радиусом ( r _i ) 54,46 мкм (±3,13).

Islet Volume

для полной трехмерной перспективы, MiLE Islet Volume _{P P ) был рассчитан в соответствии со средним диаметром островков ( D м ) классическая формула объема (5). Таким образом, средний объем островков ( V p ) показал значение 0.00068 мм ³ (686 994,29 ± 107 297,82 мкм ³ ) или 0,00069 мкл (±0,00011). Средняя трехмерная площадь поверхности островков ( A im ) показала значение 0,037 мм ² (37 464,69 ± 4 109,69 мкм ² ) и была рассчитана по формуле (6).}

Общее количество островков и их объем внутри поджелудочной железы

Аппроксимация общего количества островков и объема, который они занимают, была сделана посредством виртуализации.Рассматривалась виртуальная модель, в которой поджелудочная железа была разделена на срезы толщиной, равной среднему региональному диаметру островка ( d _i ). Далее мы считали, что каждый виртуальный срез включает в себя количество островков соответствующего региона. Таким образом, количество островков из каждого виртуального среза суммировали, чтобы выяснить общее количество островков в поджелудочной железе (7). Следовательно, количество островков в поджелудочной железе приблизилось к 3 204 588 островкам ( ~ 3.2 миллиона островков ). Выведенный по тому же правилу, что и выше, общий объем островков (8) показал значение 2 см ³ , среднее между четырьмя секциями (B1–4) при 0,5 ±0,1 см ³ ( Таблица 3). Общая площадь поверхности Islet 3D оценивалась на 1132 см ² (или 0,1 м ² ), усреднение между четырьмя разделами при 283 ± 93 см ² (Таблица 3). Наконец, наша оценка процента островков от общего объема поджелудочной железы (45 см ³ ) показала приблизительное значение 4 .487% . Средний процент островков между секциями (B1–B4) составил 1,12 ± 0,3% (см. Таблицу 3).

Таблица 3 Абсолютные и относительные значения основных параметров островков по регионам поджелудочной железы.

Распределение островков

Распределение островков внутри поджелудочной железы было одной из основных целей данного исследования. Используя тепловые карты для обзора структуры ткани поджелудочной железы, нам удалось проследить более плотные или менее плотные участки срезов (рис. 1А и рис.2Д). Мы также использовали тепловые карты для определения площади поверхности, занятой островками на каждом предметном стекле (рис. 2C). При сравнении двухмерных распределений четырех срезов первое важное наблюдение заключалось в том, что островки сгруппированы в головке поджелудочной железы. Эти группы островков постепенно распространяются по всей поджелудочной железе вплоть до области хвоста (рис. 1А и 2С, D). Обратите внимание, что начиная с головки и до хвоста поджелудочной железы темно-синяя область (низкая плотность) уменьшается в пользу светло-голубой области (более высокой плотности — рис.2С,Г). Доля островков вдоль поджелудочной железы также представляет интерес (рис. 1В). Особое наблюдение в этом случае указывает на то, что среднее количество островков на B1–4[P12] было очень небольшим по сравнению со средним количеством островков на других предметных стеклах B1–4[Px]. Не менее интересно, что среднее количество островков, присутствующих на предметных стеклах B1–4[P4] и B1–4[P15], показало самые большие значения. Кроме того, для каждого среза было выполнено как распределение числа островков и средней площади островков/препарата, так и распределение площади и периметра отдельных островков (рис. 1С–Г). Таким образом, кластеризация распределения, наблюдаемая на рис. 1Е, указывает на почти равномерное рассеяние островков в теле поджелудочной железы. Глобальная тепловая карта, представляющая перекрывающиеся распределения четырех срезов, также показывает общее количество островков (рис. 2F) и сумму всех площадей островков (рис. 2А) на B1–4 [Px]. Оба распределения, рассматриваемые с боковой стороны, показывают схожую картину. Однако, если смотреть сверху, оба распределения показывают разные модели. Если боковой рисунок показывает линейную зависимость между общим количеством островков и суммой всех площадей островков, вид сверху показывает большую площадь островков на левой стороне срезов и большее количество островков на правой стороне срезов. (Инжир.2А,Е).

Рисунок 2

Тепловая карта распределения панкреатических островков по их количеству и площади поверхности.

( A ) Глобальная тепловая карта, представляющая перекрывающиеся распределения панели C (сумма всех плотностей от B1 до B4). Желтые области представляют более высокую плотность островков, а красный цвет представляет области с более низкой плотностью, ( B ) общая площадь островков по срезам (B1–4), ( C ) тепловая карта, которая указывает площадь поверхности, занятую островками. , ( D ) тепловая карта, представляющая плотность островков в секциях B1–B4.Желтые области представляют более высокую плотность островков, а синий цвет представляет области с более низкой плотностью, ( E ) общее количество островков в каждой секции, а именно B1–B4, ( F ) глобальная тепловая карта, представляющая перекрывающиеся распределения из панели D (сумма всех площадей поверхностей B1–4). Желтые области представляют более высокую занятость поверхности островками, а красный цвет указывает на более низкую занятость поверхности.

Предпочтения по размеру островков

В соответствии с эволюционными параметрами каждого вида структура поджелудочной железы указывает на оптимальный размер ее внутренних компонентов, эндокринных или экзокринных. Наши данные свидетельствуют о том, что поджелудочная железа человека, по-видимому, «предпочитает» определенные размеры, когда речь идет об островках (таблица 4). С представленностью 67% (3614 островков) являются островки с площадью поверхности от 1000 до 10000 мкм ² (рис. 3A, C, E, G, I и таблица 4). За этим большинством с долей 24% (1305 островков) следуют островки площадью от 10 000 до 100 000 мкм ² (рис. 3A, B, D, F-I). Интересно, но не удивительно, что только 9% (493 островка) островков имеют площадь до 1000 мкм ² (рис.3С). Наконец, менее 1% представлено отдельными скоплениями островков (рис. 3I).

Таблица 4 Классификация панкреатических островков по площади их поверхности. Рисунок 3

Пропорции островков поджелудочной железы человека.

(

( A ) Группа островков (верхняя вершина -6356 мкм ² , нижний Islet-54,291 мкм ² , левый остров -6700 мкм ² ) Включен в категорию 1000-10 000 мкм ² и 10 000-100 000 мкм ² (поле зрения 20x), ( B ) Islet Пример ( B ) Islet (41,708 мкМ ² ) Входит в категорию 10 000 мкМ ² -100 000 мкм ² (поле View 20x) , ( C ) выборка островков (верхний островок −386 мкм ² , нижний островок −8814 мкм ² ), входящих в категорию <1000 мкм ² и 1000–10000 7мкм (поле 20 10 000 9019 мкм) 40X), ( D ) островок (20,368 мкм ² ) относящийся к категории 10,000–100,000 мкм ² (поле зрения 20X), ( E ) 1 0m 902 включен пример островка (6282 в категории 1000–10 000 мкм ² (поле зрения 40X), ( F ) островковый образец (8805 мкм ² ) включен в категорию 10 000–100 ,000 мкм ² (поле зрения 40X), ( G ) группа островков (верхний левый островок −14,930 мкм ² , нижний островок −136 мкм ² , нижний правый островок −140902 2 ) в диапазоне от 1000 до 10 000 мкм ² до 10 000-100 000 мкм ² (поле зрения 20x), ( H ) Пример острова (29 975 мкм ² ) Включен в категорию 10 000-100 000 мкм. ² (поле зрения 20X), ( I ) процент островков по размеру, ( K ) средняя площадь островков (темно-серый на правой оси) и средний периметр островков (светло-серый на левой оси) по срезам (В1–4).

Формы островков

Форма островков обеспечивает уникальное расположение клеток ⁹ . Недавние данные свидетельствуют о том, что многие изменения в структуре и функции островков, связанные с диабетом, связаны только с гипергликемией и исчезают при нормализации уровня глюкозы в крови ²⁶ . Таким образом, уникальность этой гетерогенной конформации имеет глубокое функциональное значение. Островки поджелудочной железы имеют различную форму и обычно трудно поддаются определению в этом отношении. В нашем случае рассматривались два основных вопроса: 1) насколько островки Лангерганса близки к идеальной сферической структуре в различных областях поджелудочной железы человека? 2) если панкреатические островки слишком далеки от идеальной сферической структуры, то насколько они неправильны по форме? Что касается первого вопроса, мы разработали индекс сферичности ( I _s ) с учетом двух параметров островков (9). Абсолютное значение периметра островка ( P _м ), измеренное на двумерных гистологических предметных стеклах, и относительный параметр, а именно средний диаметр островка ( d _м ). Однако в качестве первой точки отсчета мы использовали отношение между периметром окружности ( Cp ) и диаметром ( Cd ), а именно π (7). Затем те же шаги были применены для отношения ( I _π ) между средним периметром островка и средним диаметром островка (8).Расстояние от идеальных пропорций было количественно определено через показатель сферичности ( I _s ), в данном случае как отношение между π и I _π (9). Таким образом, мы грубо измерили, насколько форма островка отличается от идеальной формы круга (и, следовательно, от идеальной сферы). Учитывали средний периметр и диаметр островка для каждого среза (B1–4) поджелудочной железы и оценивали расстояния от идеальных пропорций круга (π) (табл. 5).Так, островки неправильной формы показали диспропорцию между периметром и диаметром ( I _s имеет тенденцию к удалению от 1 к более высоким положительным значениям), а островки круглой формы приблизились к пропорциям периметра и диаметра окружности ( I _s больше склоняется к 1). Островки из хвоста поджелудочной железы показывают отношение ( I _π  = 3,2526) ближе к π, что позволяет предположить, что в среднем островки из хвоста поджелудочной железы ближе к идеальной сферической структуре по сравнению с другими участками ( I _с  = 1.0353). Этот метод также предполагает, что островки, расположенные в шейке поджелудочной железы, имеют пропорции ( I _π  = 3,3268), которые наиболее далеки от идеальных (π) и демонстрируют различные неправильные формы островков ( I _s  = 1,0589).

Таблица 5 Оценка сферичности островков.

Скопления островков

Что касается нашего исследования, возможно, одним из самых интересных наблюдений было обнаружение скоплений островков.Распределение островков по площади поверхности, по-видимому, указывает на «пороговый» размер выше 100 000 мкм ² (рис. 1K, L). Похоже, что более крупные островки, площадь которых превышает 100 000 мкм ² , обычно представляют собой скопления островков (рис. 4A–D). По нашим наблюдениям, структуры, находящиеся выше этих размеров, представляют собой скопления островков. Двойные слепые морфометрические измерения выявили в общей сложности 11 скоплений островков на всех четырех срезах (рис. 1K, L). Шесть кластеров были обнаружены в срезе головки (B1) поджелудочной железы, три в срезе шеи (B2) и два в срезе хвоста (B3).В срезе тела (Б4) поджелудочной железы отсутствовали кластероподобные островковые структуры (рис. 1Л, М). Более того, эти скопления островков, по-видимому, располагаются на периферии поджелудочной железы. Соответствующий пример кластера островков находится в шейке поджелудочной железы и представлен слайдом B2[P14], где ацинарная ткань и кровеносные сосуды интеркалированы среди групп островков (рис. 4B, D). При ближайшем рассмотрении можно наблюдать границы инкапсуляции между островками, расположенными в кластере (рис. 4Г). Учитывая известную неоднородность этого органа, мы задались вопросом, являются ли эти скопления обычно частью поджелудочной железы здорового человека (у лиц без семейной предрасположенности к СД1 или СД2) или они являются просто особенностью, характерной только для этого конкретного поджелудочная железа.В будущем мы намерены изучить этот орган у других доноров-людей, чтобы увидеть, регулярно ли эти структуры обнаруживаются в поджелудочной железе здорового человека. Кроме того, кластеры островков могут иметь решающее значение для процедур трансплантации островков. Наши данные показывают, что скопления островков состоят из небольших островков, которые плотно собираются вдоль более крупных кровеносных сосудов (рис. 4B, D). Маленькие островки человека менее уязвимы к гипоксии и состоят из большего количества β-клеток с более высоким содержанием инсулина, чем большие островки ^27,28 . Хотя тело и хвост поджелудочной железы содержат множество мелких одиночных островков, которые можно легко выделить, при пересадке в воротную вену печени они лишены интимных связей с магистральным кровотоком.С другой стороны, наши данные показывают, что скопления островков чаще появляются в головке и шейке поджелудочной железы (рис. 1K). Таким образом, кластеры островков содержат более крупные кровеносные сосуды, которые могут быть непосредственно связаны микрохирургическими методами с кровотоком пациента (рис. 4B, D). Возможно, их микрохирургическая изоляция также будет проблематичной, учитывая, что эти анатомические структуры могут быть особенно редкими и трудно найти in vivo . Тем не менее, гетерогенность поджелудочной железы, возможно, превосходит только перипанкреатическая жировая ткань, где в этом случае были сделаны другие наблюдения. Внутри поджелудочной железы иммунные реакции отсутствовали. В перипанкреатической жировой ткани эти иммунные ответы были захвачены кровеносными сосудами (рис. 4F). Кроме того, в перипанкреатической жировой ткани наблюдалось множество различных лимфоидных структур (рис. 4Е). Таким образом, представляется, что воспалительный процесс в перипанкреатической ткани может быть постоянным, динамичным и общим процессом, окружающим поджелудочную железу здорового человека. Эти два наблюдения заставляют нас полагать, что перипанкреатическая жировая ткань активно участвует в механизмах инициации как СД1, так и СД2 (в отношении генетической предрасположенности к тому или иному фенотипу).Эти наблюдения заставляют нас задаться вопросом, возможно ли, что иммунный ответ на бета-клетки на самом деле инициируется посредством индукции из перипанкреатической ткани.

Рисунок 4

Скопления островков и существующий воспалительный процесс в перипанкреатической жировой ткани.

( A ) относительное расположение скопления островков на предметном стекле B2 (P14) (шейка поджелудочной железы). На панели также показано относительное расположение шейки поджелудочной железы и полученная на ее основе тепловая карта, которая дополнительно указывает площадь поверхности, занятую островками.( B ) границы скопления островков (черная пунктирная линия) на предметном стекле B2 (P14) (поле зрения 4x), ( C ) окно в нижней части скопления островков (красная пунктирная линия), ( D ) крупный вид островков внутри скопления (поле зрения 20x), ( E ) лимфоидно организованная ткань внутри перипанкреатической жировой ткани, взятая из головного среза поджелудочной железы (поле зрения 10x). Красноватое пятно слева представляет собой ошибку обработки. ( F ) Воспалительный процесс, захваченный на кровеносном сосуде, взятом из перипанкреатической жировой ткани хвостового среза поджелудочной железы (поле зрения 20х).Кровеносный сосуд заполнен эритроцитами и воспалительными клетками (нейтрофилами, лимфоцитами, эозинофилами).

Органоиды поджелудочной железы человека: на шаг ближе к пониманию биологии и лечению заболеваний

Авторы этой недавней статьи, опубликованной в BMC Developmental Biology, представляют новый способ изучения того, что происходит внутри поджелудочной железы, путем создания «органоидов поджелудочной железы человека». Используя клетки, взятые из поджелудочной железы человека, авторы создают самособирающиеся тканеподобные структуры, которые имитируют человеческую поджелудочную железу на гораздо более простом уровне, помогая нам понять развитие, форму и функцию органа.В этом исследовании они не только способны генерировать эти «мини» органоиды поджелудочной железы, но и идут дальше, способствуя их размножению в течение длительных периодов времени с устойчивой генетической стабильностью. Они надеются, что эта клеточная технология поможет разрушить процессы на клеточном и тканевом уровне, которые происходят с течением времени, чтобы углубить наше понимание в отношении более эффективных терапевтических вмешательств, решения проблем на начальном этапе заболеваний, вызванных поджелудочной железой, таких как диабет, рак поджелудочной железы и многое другое. Эти и подобные клеточные технологии приведут нас к более глубокому пониманию и более эффективному лечению болезней.

Николь Прайор, Никитас Георгакопулос и Мериткселл Хуч 26 фев. 2020

Органоиды представляют собой новую технологию органоспецифической тканевой культуры клеток в трехмерном внеклеточном матриксе (ECM). Это приводит к образованию трехмерных клеточных кластеров, которые воспроизводят многие характеристики органов происхождения.Текущие усилия по разработке моделей человеческих органоидов помогут нам лучше понять, как формируются и функционируют наши органы, и как помочь в случаях возникновения заболеваний.

В нашем исследовании, опубликованном в журнале BMC Developmental Biology, мы описываем получение органоидов поджелудочной железы человека (hPO) и показываем, как их можно использовать в будущих исследованиях. Поджелудочная железа расположена рядом с желудком и играет важную роль в нашей пищеварительной системе. В поджелудочной железе обнаружены три основных типа клеток; 1) эндокринные клетки , которые находятся в островках Лангерганса и вырабатывают гормоны, включая инсулин, которые контролируют метаболизм сахара в нашем организме, 2) ацинарные клетки , которые производят пищеварительные ферменты, и 3) клетки протоков поджелудочной железы , которые образуют протоки (выделены на рис. 1) для сбора пищеварительных ферментов и транспортировки их в тонкую кишку, чтобы способствовать расщеплению пищи.

Рисунок 1: Поджелудочная железа является частью пищеварительной системы, обратите внимание на связь поджелудочной железы с кишечником через проток поджелудочной железы. Изображение адаптировано из материалов Blausen.com (2014 г.).

Сотрудники Blausen.com (2014 г.). «Медицинская галерея Blausen Medical 2014». ВикиЖурнал медицины 1 (2). DOI: 10.15347/wjm/2014.010. ISSN 2002-4436.

Нарушение работы этих клеток связано с рядом заболеваний поджелудочной железы. Рак поджелудочной железы может поражать любой из этих типов клеток и имеет самый низкий показатель выживаемости в Великобритании среди всех видов рака.Диабет является наиболее распространенным заболеванием эндокринной системы и поражает более 4 миллионов человек в Великобритании. Другие серьезные заболевания, хотя, возможно, менее известные, включают панкреатит (воспаление поджелудочной железы), муковисцидоз (поражающий клетки протоков) и недостаточность поджелудочной железы (снижение функции ацинарных клеток). Тяжелые случаи заболевания поджелудочной железы часто оставляют пациентов с необходимостью пересадки поджелудочной железы или островковых клеток, полученных от умерших доноров органов. Однако самые большие препятствия для трансплантации поджелудочной железы включают ограниченное количество доноров органов и необходимость пожизненной иммуносупрессии.

Мы стремились создать систему 3D-культивирования для долгосрочного размножения hPO, которая послужит основой для изучения клеток протоков поджелудочной железы, заболеваний поджелудочной железы и разработки клеточной терапии диабета. При разработке модели hPO мы знали, что для применения клеточной терапии в клинике она должна соответствовать определенным критериям, включающим размножение клеток химически определенным способом, совместимым с Надлежащими производственными процессами (GMP), с убедительными доказательствами того, что клетки не представляют риск образования опухоли.

Чтобы создать hPO, мы выделили фрагменты протоков из небольших образцов ткани поджелудочной железы человека и поместили их в ECM, чтобы он действовал как 3D-каркас. Чтобы это было успешным, мы должны были разработать культуральную среду, которая включала бы все сигналы и факторы роста, необходимые для поддержки перехода протоков поджелудочной железы в расширяемые органоиды поджелудочной железы (рис. 2). Благодаря серии оптимизаций и итераций, в которых мы тестировали активаторы и ингибиторы ключевых сигнальных путей клеток, мы получили культуральную среду с определенным химическим составом, которая поддерживает долгосрочное культивирование клеток поджелудочной железы. Кроме того, мы разработали протокол для замораживания ткани поджелудочной железы и извлечения из нее здоровых долговременно расширяющихся органоидов. Это дает нам возможность хранить ткани, делиться образцами и получать органоиды позднее.

Рис. 2. Протоки поджелудочной железы человека можно культивировать in vitro и размножать в виде органоидов поджелудочной железы.

Важно отметить, что генетический анализ показал, что даже после долговременной экспансии hPOs не обнаруживали больших генетических аномалий. Это очень важно, так как накопление генетических дефектов во время культивирования может изменить поведение клеток и повлиять на результаты.Мы также обнаружили, что при трансплантации этих клеток в поджелудочную железу мышей клетки hPO не образуют опухолей, что свидетельствует об их генетической безопасности как in vitro, так и in vivo.

Наконец, мы стремились разработать химически определенный ECM, в котором можно культивировать hPO, поскольку обычно используемые ECM (Matrigel и BME 2-RGF) имеют животное происхождение и не подходят для клеточной терапии. В сотрудничестве с Cellendes, компанией, специализирующейся на гидрогелевых технологиях, мы впервые смогли продемонстрировать образование и распространение hPO в гидрогеле с полностью определенным химическим составом.

Наша демонстрация долговременной экспансии органоидов поджелудочной железы человека в определенных химических условиях делает эту систему интересной для многих областей исследований (рис. 3). Эта система может быть использована в качестве модели биологии здоровой протоковой поджелудочной железы и разработки моделей заболеваний протокового компартмента, таких как кистозный фиброз. Органоиды также могут быть получены из болезненных состояний и уже использовались для моделирования различных типов рака поджелудочной железы (PDAC и IPMN).

Рисунок 3: Органоиды поджелудочной железы человека потенциально могут быть использованы во многих областях исследований, таких как исследования здоровых тканей, пораженных тканей и регенеративная медицина.

Важно отметить, что наш протокол не основан на изменении генома или идентичности клеток для достижения долгосрочной экспансии. Это, в сочетании с отсутствием образования опухоли при трансплантации мышам, делает hPO безопасным подходом для потенциальной клеточной терапии. Клеточная терапия дает надежду пациентам, у которых нет доступных вариантов лечения. Они обеспечивают возможность лечения заболевания путем извлечения клеток у пациента или других доноров, изменения их в лаборатории для создания рабочих клеток и трансплантации их пациенту.Теоретически это будет лечить болезнь, устраняя необходимость в иммуносупрессии, поскольку клетки будут либо собственными, либо очень близкими к пациенту.

Адаптация системы культивирования для клеток человека финансировалась в рамках программы ЕС (LSFM4LIFE), целью которой является изучение потенциала hPO в качестве клинической клеточной терапии. Могут ли hPO быть источником для трансплантации клеточной терапии при диабете, еще предстоит выяснить.

 

.