Органоид осуществляющий транспорт веществ в клетке: 19 Одномембранный органоид , осуществляющий транспорт веществ , синтез жиров , углеводов и сложных белков

Содержание

Сайт учителей биологии МБОУ Лицей № 2 города Воронежа

Органоиды клетки и их функции

Все органоиды клеток делятся на две группы: мембранные и немембранные.

Большинство внутриклеточных структур принадлежит к мембранным органоидам, у которых содержимое отделено от цитоплазмы биологическими мембранами. К ним относятся эндоплазматическая сеть, комплекс Гольджи, митохондрии, лизосомы, пластиды. Митохондрии и пластиды являются двухмембранными органоидами. Немембранными органоидами, которые образованы без участия мембран, являются рибосомы, микротрубочки, клеточный центр. Все названные органоиды имеются в клетках эукариот. В клетках прокариот содержатся лишь рибосомы.

Каждый органоид осуществляет определённые функции, жизненно необходимые для клетки.

Одномембранные органоиды

Эндоплазматическая сеть, или ЭПС (греч. эндон — внутри и плазма — образование) — одномембранный органоид – это сложная система в виде трубочек, мешочков, плоских цистерн разных размеров.

Они объединены в единую замкнутую полость и отграничены от содержимого цитоплазмы биологической мембраной, образующей многочисленные складки и изгибы. Из плоских цистерн в клетках растений образуются вакуоли.

Эндоплазматическая сеть разделяет цитоплазму на отдельные отсеки, в которых одновременно могут проходить различные химические процессы, не мешая друг другу. Различают шероховатую и гладкую эндоплазматическую сеть. «Шероховатость» вызвана многочисленными рибосомами, усеивающими поверхность мембран, где происходит процесс синтеза белков в клетке. Гладкая эндоплазматическая сеть синтезирует различные липиды и углеводы. Эндоплазматическая сеть не только синтезирует и накапливает в своих цистернах различные вещества, но и участвует в их внутриклеточной транспортировке.

Особенности строения:

Сеть полостей, канальцев, трубочек построенных из мембран.
2 типа – гладкая и шероховатая.
На мембранах шероховатой ЭПС расположены рибосомы.

Выполняемые функции:

Осуществляет синтез органических веществ и их транспорт по клетке.
На мембранах гладкой ЭПС синтезируются углеводы и липиды.
На мембранах шероховатой ЭПС синтезируются белки.

Комплекс Гольджи (аппарат Гольджи) — одномембранный органоид клетки. Состоит из цистерн, трубчатых структур, вакуолей и транспортных пузырьков. В клетке может быть один комплекс или несколько. Его основная функция – накопление и «упаковка» химических соединений, синтезируемых в клетке. Комплекс Гольджи взаимодействует с эндоплазматической сетью, получая от нее новообразованные белки и другие выделяемые клеткой вещества. В структурах комплекса Гольджи эти вещества накапливаются, сортируются и могут долгое время храниться в цитоплазме как запас, пока клетка их не востребует.

Особенности строения:

Замкнутые мембранные полости, трубочки и пузырьки.
Связаны с эндоплазматической сетью.

Выполняемые функции:

Осуществляет накопление и транспорт органических веществ синтезированных в клетке.
Вещества накапливаются в полостях и подвергаются химической модификации.
Гормоны и ферменты, способные разрушать органические вещества упаковываются в мембранные пузырьки.
Участвует в образовании лизосом.

Лизосома (от греч. lysis – «растворение» и soma – «тело») – округлый одноцветный органоид. Лизосомы наполнены специальными пищеварительными ферментами. Основная функция лизосом – внутриклеточное пищеварение. Продукты переваривания поступают в цитоплазму клетки.

Особенности строения:

Замкнутые одномембранные тельца овальной формы.
Содержат ферменты.

Выполняемые функции:

Участвуют в расщеплении органических веществ поступающих в клетку в результате фагоцитоза и пиноцитоза, образуют пищеварительные вакуоли.
Способствуют разрушению отмерших органоидов клетки.
Уничтожают отмирающие клетки, и даже органы (утрата хвоста у головастика).

Вакуоли — полости в цитоплазме растительных клеток, ограниченные мембраной и заполненные жидкостью — клеточным соком, состав которого отличается от окружающей цитоплазмы. Вакуоль окружена полупроницаемой мембраной — тонопластом.

Одна из важных функций растительных вакуолей — накопление запасных питательных веществ и регуляция водно-солевого обмена, поддержание тургора клетки, т. е. вакуоль контролирует поступление воды в клетку и из клетки.

Во многих зрелых клетках растений они составляют более половины объёма клетки.

Особенности строения:

Отделяются от цитоплазмы мембраной.
Содержат клеточный сок.
Могут содержать красящие вещества (пигменты).
Как правило, у молодых клеток несколько мелких вакуолей, у старых клеток – одна крупная вакуоль.

Выполняемые функции:

Поддержание тургора в клетке.

Резервуар воды.
В них могут накапливаться питательные вещества и ненужные клетке продукты жизнедеятельности.

Клеточный сок — водянистая жидкость, заполняющая вакуоли, которая содержит органические и неорганические соли, глюкозу, аминокислоты, белки, конечные и токсичные продукты обмена веществ, а также пигменты и катионы калия. Состав клеточного сока специфичен для каждого вида, зависит от условий произрастания и возраста растения.
Основная функция клеточного сока — обеспечение осмоса и тургора клеток (т. е. поддержание упругости тканей и органов).

10кл РУС

Биология

10 класс

1. Азот как химический элемент входит в состав:

А –липидов, углеводов, нуклеиновых кислот

Б –жиров, АТФ, углеводов

В –жиров, белков, углеводов

Г –белков, АТФ, нуклеиновых кислот

2.Основная функция углеводов в клетке:

А –ферментативно — каталитическая

Б –хранение наследственной информации

В –энергетическая

Г –регуляторная

3.Ферменты по химическому строению являются:

А – белками

Б –жирами

В –углеводами

Г –нуклеотидами

4.Универсальным источником энергии для всех реакций, протекающих в клетке, является:

А –ДНК

Б –тРНК

В –АТФ

Г –иРНК

5.Основные положения клеточной теории сформулировали:

А –Т.Шванн и М.Шлейден

Б –Р.Гук и Р.Броун

В –Ч.Дарвин и К.Бэр

Г –Г.Мендель и Т.Морган

6.Положением клеточной теории является утверждение:

А –клеточное строение всех ныне живущих организмов свидетельствует о единстве их происхождения

Б –клеточное строение всех ныне живущих организмов свидетельствует о сложности строения живых систем

В –клетки всех организмов выполняют одинаковые функции

Г –клетки в организмах растений и животных возникают из неклеточного вещества

7. Организмы, клетка которых имеет оформленное ядро:

А –одноклеточные

Б –эукариоты

В –многоклеточные

Г –прокариоты

8.Прокариотами являются:

А –бактерии и сине-зеленые водоросли

Б –простейшие и растения

В –животные и грибы

Г –вирусы

9.В состав хромосом входят вещества:

А –жиры и углеводы

Б –АТФ и РНК

В –белки и ДНК

Г –РНК и липиды

10.Гомологичные хромосомы:

А –содержат гены, отвечающие за разные признаки

Б –то же, что и хроматиды

В –содержат одинаковый набор генов, но попали в зиготу от разных родителей

Г –отличаются друг от друга по форме и размерам

11. Органоид, связывающий клетку в единое целое, осуществляющий транспорт веществ, участвующий в синтезе липидов, делящий клетку на секции, в которых одновременно происходят различные химические реакции:

А –эндоплазматическая сеть

Б –наружная клеточная мембрана

В –комплекс Гольджи

Г –цитоплазма

12. Двухмембранный органоид, встречающийся только в растительных клетках:

А –митохондрия

Б –пластида

В –эндоплазматическая сеть

Г –рибосома

13.В клетке бактерий располагается:

А –одна кольцевая молекула ДНК

Б –одна линейная молекула ДНК

В –несколько кольцевых молекул ДНК

Г –несколько линейных молекул ДНК

14.Совокупность процессов ассимиляции и диссимиляции:

А –катаболизм

Б –анаболизм

В –метаболизм

Г –нейтрализм

15.В результате какого этапа энергетического обмена из одной молекулы глюкозы образуются 2 молекулы пировиноградной кислоты и 2 молекулы АТФ:

А –подготовительного

Б –полного окисления(дыхания)

В –бескислородного

Г –хемосинтеза

16.Развитие организма животного, которое включает зиготу, бластулу, гаструлу, нейрулу и органогенез, называют:

А –личиночным

Б –с полным превращением

В –эмбриональным

Г –с неполным превращением

17. Поперечно-полосатая мускулатура, почки и половые органы образуются из:

А –эктодермы

Б –мезодермы

В –энтодермы

Г –мезенхимы

18.Анализирущим называется скрещивание исследуемой особи с:

А –гомозиготной доминантной особью

Б –гетерозиготной особью

В –гомозиготной рецессивной особью

Г –особью с аналогичным генотипом

19.Третий закон Г.Менделя называется законом:

А –независимого наследования признаков

Б –частоты гамет

В –гомологических рядов в наследственной изменчивости

Г –единообразия первого поколения

20.Сцепление генов не бывает абсолютным, так как может нарушаться в результате:

А –кроссинговера в ходе мейоза

Б –взаимодействия неаллельных генов

В –независимого расхождения хромосом в ходе мейоза

Г –случайного расхождения хроматид в ходе митоза

21.Эволюционно закрепленные адаптивные реакции организма в ответ на изменение условий внешней среды при неизменном генотипе — это изменчивость:

А –мутационная

Б –модификационная

В –комбинативная

Г –хромосомная

22. Стойкое изменение генотипа, происходящее под действием факторов внешней и внутренней среды:

А –фенотип

Б –ген

В –мутация

Г –норма реакции

23.Рецессивные мутации:

А –затрагивают все признаки организма

Б –всегда вредны

В -не проявляются фенотипически

Г –всегда проявляются фенотипически

24.В селекции при скрещивании чистых линий между собой наблюдается явление:

А –полиплоидии

Б –гетерозиса

В –межвидового скрещивания

Г –близкородственного скрещивания(инбридинга)

25.В основе методов селекции животных, растений и микроорганизмов лежит:

А –изменение условий окружающей среды

Б –наследственная изменчивость и искусственный отбор

В –наследственная изменчивость и естественный отбор

Г –ненаследственная изменчивость и искусственный отбор

Функции мембранных органелл клетки живого организма

Функции мембранных органелл клетки живого организма.

Основные группы органелл. Органеллы — постоянные внутриклеточные структуры, имеющие определенное строение и выполняющие соответствующие функции. Органеллы делятся на две группы: мембранные и немембранные. Мембранные органеллы представлены двумя вариантами: двумембранным и одномембранным. Двумембранными компонентами являются пластиды, митохондрии и клеточное ядро. К одномембранным относятся органеллы вакуолярной системы — эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи, лизосомы, вакуоли растительных и грибных клеток, пульсирующие вакуоли и др. К немембранным органеллам принадлежат рибосомы и клеточный центр, постоянно присутствующие в клетке. Выраженность элементов цитоскелета (постоянного компонента клетки) может значительно меняться в течение клеточного цикла — от полного исчезновения одного компонента (например, цитоплазматических трубочек во время деления клетки) до появления новых структур (веретена деления) .

Общим свойством мембранных органелл является то, что все они построены из липопротеидных пленок (биологических мембран) , замыкающихся сами на себя так, что образуются замкнутые полости, или отсеки. Внутреннее содержимое этих отсеков всегда отличается от гиалоплазмы.

Двумембранные органеллы. К двумебранным органеллам относятся пластиды и митохондрии. Пластиды —характерные органеллы клеток автотрофных эукариотических организмов. Их окраска, форма и размеры весьма разнообразны. Различают хло-ропласты, хромопласты и лейкопласты.

Одномембранные органоиды

1. Эндоплазматическая сеть (ЭПС)

ЭПС — это одномембранный органоид, состоящий из полостей и канальцев, соединенных между собой. Эндоплазматическая сеть структурно связана с ядром: от наружной мембраны ядра отходит мембрана, образующая стенки эндоплазматической сети. ЭПС бывает 2 видов: шероховатая (гранулярная) и гладкая (агранулярная). В любой клетке присутствуют оба вида ЭПС.

На мембранах шероховатой ЭПС располагаются многочисленные мелкие гранулы — рибосомы, специальные органоиды, с помощью которых синтезируются белки. Поэтому нетрудно догадаться, что на поверхности шероховатой ЭПС синтезируется белки, которые проникают внутрь шероховатой ЭПС и по ее полостям могут переместиться в любое место клетки.

Мембраны гладкой ЭПС лишены рибосом, но зато в ее мембранах встроены ферменты, осуществляющие синтез углеводов и липидов. После синтеза углеводы и липиды тоже могут перемещаться по мембранам ЭПС в любое место клетки Степень развития вида ЭПС зависит от специализации клетки. Например, в клетках, синтезирующих белковые гормоны, будет лучше развита гранулярная ЭПС, а в клетках , синтезирующих жироподобные вещества — агранулярная ЭПС.

Функции ЭПС:

Синтез веществ. На шероховатой ЭПС синтезируются белки, а на гладкой — липиды и углеводы.
Транспортная функция. По полостям ЭПС синтезированные вещества перемещаются в любое место клетки.

2. Комплекс Гольджи

Комплекс Гольджи (диктиосома) представляет собой стопку плоских мембранных мешочков, которые называются цистернами. Цистерны полностью изолированы друг от друга и не соединяются между собой. По краям от цистерн ответвляются многочисленные трубочки и пузырьки. От ЭПС время от времени отшнуровываются вакуоли (пузырьки) с синтезированными веществами, которые перемещаются к комплексу Гольджи и соединяются с ним. Вещества, синтезированные в ЭПС, усложняются и накапливаются в комплексе Гольджи.

Функции комплекса Гольджи:

В цистернах комплекса Гольджи происходит дальнейшее химическое преобразование и усложнение веществ, поступивших в него из ЭПС. Например, формируются вещества, необходимые для обновления мембраны клетки (гликопротеиды, гликолипиды), полисахариды.
В комплексе Гольджи происходит накопление веществ и их временное «хранение»
Образованные вещества «упаковываются» в пузырьки (в вакуоли) и в таком виде перемещаются по клетке.
В комплексе Гольджи образуются лизосомы (сферические органоиды с расщепляющими ферментами).

3. Лизосомы («лизис» — распад, растворение)

Лизосомы — мелкие сферические органоиды, стенки которых образованы одинарной мембраной; содержат литические (расщепляющие) ферменты. Сначала лизосомы, отшнуровавшиеся от комплекса Гольджи, содержат неактивные ферменты. При определенных условиях их ферменты активизируются. При слиянии лизосомы с фагоцитозной или пиноцитозной вакуолью образуется пищеварительная вакуоль, в которой происходит внутриклеточное переваривание различных веществ.

Функции лизосом:

Осуществляют расщепление веществ, поглощенных в результате фагоцитоза и пиноцитоза. Биополимеры расщепляются до мономеров, которые поступают в клетку и используются на ее нужды. Например, они могут быть использованы для синтеза новых органических веществ или могут подвергаться дальнейшему расщеплению для получения энергии.

Разрушают старые, поврежденные, избыточные органоиды. Ращепление органоидов может происходить и во время голодания клетки.

Осуществляют аутолиз (расщепление) клетки (рассасывание хвоста у головастиков, разжижение тканей в зоне воспаления, разрушение клеток хряща в процессе формирования костной ткани и др. ).

4. Вакуоли

Вакуоли — сферические одномембранные органоиды, представляющие собой резервуары воды и растворенных в ней веществ. К вакуолям относятся: фагоцитозные и пиноцитозные вакуоли, пищеварительные вакуоли, пузырьки, отшнуровывающиеся от ЭПС и комплекса Гольджи. Вакуоли животной клетки — мелкие, многочисленные, но их объем не превышает 5% от всего объема клетки. Их основная функция — транспорт веществ по клетке, олсуществление взаимосвязи между органоидами.

В клетке растений на долю вакуолей приходится до 90% объема. В зрелой растительной клетки вакуоль одна, занимает центральное положение. Мембрана вакуоли растительной клетки — тонопласт, ее содержимое — клеточный сок. Функции вакуолей в растительной клетке: поддержание клеточной оболочки в напряжении, накопление различных веществ, в том числе отходов жизнедеятельности клетки. Вакуоли поставляют воду для процессов фотосинтеза.

В состав клеточного сока могут входить:

— запасные вещества, которые могут использоваться самой клеткой (органические кислоты, аминокислоты, сахара, белки).

— вещества, которые выводятся из обмена веществ клетки и накапливаются в вакуоли (фенолы, дубильные вещества, алкалоиды и др.)

— фитогормоны, фитонциды,

— пигменты (красящие вещества), которые придают клеточному соку пурпурный, красный, синий, фиолетовый цвет, а иногда желтый или кремовый. Именно пигменты клеточного сока окрашивают лепестки цветков, плоды, корнеплоды

Канальцево-вакуолярная система клетки (система транспорта и синтеза веществ)

ЭПС, комплекс Гольджи, лизосомы и вакуоли составляют единую канальцево-вакуолярную систему клетки. Все ее элементы имеют сходный химический состав мембран, поэтому возможно их взаимодействие. Все элементы КВС берут начало от ЭПС. От ЭПС отшнуровываются вакуоли, поступающие к комплексу Гольджи, от комплекса Гольджи отшнуровываются пузырьки, сливающиеся с мембраной клетки, лизосомы.

Значение КВС:

-Мембраны КВС делят содержимое клетки на отдельные отсеки (компартменты), в которых протекают определенные процессы. Это делает возможным одновременное протекание в клетке различных процессов, иногда прямопротивоположных.

-В результате деятельности КВС происходит постоянное обновление мембраны клетки.

Двумембранные органоиды

Двумембранный органоид — это полая структура, стенки которой образованы двойной мембраной. Известно 2 вида двумембранных органоидов: митохондрии и пластиды. Митохондрии характерны для всех клеток эукариот, пластиды встречаются только в клетках растений. Митохондрии и пластиды являются компонентами энергетической системы клетки, так в результате их функционирования синтезируется АТФ.

1. Строение и функции митохондрий

Митохондрия – двумембранный полуавтономный органоид, осуществляющий синтез АТФ.

Форма митохондрий разнообразна, они могут быть палочковидными, нитевидными или шаровидными. Стенки митохондрий образованы двумя мембранами: внешней и внутренней. Внешняя мембрана — гладкая, а внутренняя образует многочисленные складки — кристы. Во внутренней мембране встроены многочисленные ферментные комплексы, которые осуществляют синтез АТФ.

Складчатость внутренней мембраны имеет большое значение. На складчатой поверхности может расположиться больше ферментных комплексов, чем на гладкой поверхности. Количество складок в митохондрии может изменяться в зависимости от потребности клеток в энергии.Если клетка нуждается в энергии, то число крист увеличивается. Соответственно увеличивается и число ферментных комплексов, расположенных на кристах. В результате будет образовано большее количество АТФ. Кроме того, в клетке может возрастать общее количество митохондрий. Если клетка не нуждается в большом количестве энергии, то количество митохондрий в клетке снижается и уменьшается количество крист внутри митохондрий.

Внутреннее пространство митохондрий заполнено бесструктурным однородным веществом (матриксом). В матриксе располагаются кольцевые молекулы ДНК, РНК и мелкие рибосомы (как у прокариот). В ДНК митохондрий записана информация о строении митохондриальных белков. РНК и рибосомы осуществляют их синтез. Рибосомы митохондрий мелкие, по строению они очень похожи на рибосомы бактерий.. Некоторые ученые считают, что митохондрии образовались из бактерий, проникших в эукариотическую клетку Возможно, это происходило на начальных этапах возникновения жизни.

Митохондрии называют полуавтономными органоидами. Это означает, что они зависят от клетки, но в то же время сохраняют некоторую самостоятельность. Так, например, митохондрии сами синтезируют собственные белки, в том числе и ферменты своих ферментных комплексов. Кроме того, митохондрии могут размножаться путем деления независимо от деления клетки.

2. Пластиды

В клетках растений есть особые двумембранные органоиды — пластиды. Различают 3 вида пластид: хлоропласты, хромопласты, лейкопласты.

Хлоропласты имеют оболочку из 2 мембран. Наружная оболочка гладкая, а внутренняя образует многочисленные пузырьки (тилакоиды). Стопка тилакоидов — грана. Граны располагаются в шахматном порядке для лучшего проникновения солнечного света. В мембранах тилакоидов встроены молекулы зеленого пигмента хлорофилла, поэтому хлоропласты имеют зеленый цвет. С помощью хлорофилла осуществляется фотосинтез. Таким образом, главная функция хлоропластов — осуществление процесса фотосинтеза.

Пространство между гранами заполнено матриксом. В матриксе находятся ДНК, РНК, рибосомы (мелкие, как у прокариот), капли липидов, зерна крахмала.

Хлоропласты, так же как и митохондрии, являются полуавтономными органоидами растительной клетки, так как могут самостоятельно синтезировать собственные белки и способны делиться независимо от деления клетки.

Хромопласты — пластиды, имеющие красную, оранжевую или желтую окраску. Окраску хромопластам придают пигменты каротиноиды, которые расположены в матриксе. Тилакоиды развиты слабо или вообще отсутствуют. Точная функция хромопластов неизвестна. Возможно, они привлекают к созревшим плодам животных.

Лейкопласты — бесцветные пластиды, расположены в клетках бесцветных тканей. Тилакоиды неразвиты. В лейкопластах накапливается крахмал, липиды и белки.

Пластиды могут взаимно превращаться друг в друга: лейкопласты — хлоропласты — хромопласты.

2.Функциональная организация скелетных мышц.

Скелетные мышцы человека содержат около 300 млн. мышечных волокон и имеют площадь порядка 3 м2. Целая мышца представляет собой отдельный орган, а мышечное волокно — клетку. Мышцы иннервируются двигательными нервами, передающими из центров моторные команды, чувствительными нервами, несущими в центры информацию о напряжении и движении мышц, и симпатическими нервными волокнами, влияющими на обменные процессы в мышце. Функции скелетных мышц заключаются в перемещении частей тела друг относительно друга, перемещении тела в пространстве (локомоция) и поддержании позы тела.

Функциональной единицей мышцы является двигательная единица, состоящая из мотонейрона спинного мозга, его аксона (двигательного нерва) с многочисленными окончаниями и иннервируемых им мышечных волокон. Возбуждение мотонейрона вызывает одновременное сокращение всех входящих в эту единицу мышечных волокон. Двигательные единицы (ДЕ) небольших мышц содержат малое число мышечных волокон (ДЕ мышц глазного яблока 3-6 волокон, мышц пальцев руки 10-25 волокон), а ДЕ крупных мышц туловища и конечностей — до нескольких тысяч (например, ДЕ икроножной мышцы человека — около 2000 мышечных волокон).

Мелкие мышцы иннервируются из одного сегмента спинного мозга, а крупные мышцы—мотонейронами 2-3 спинальных сегментов. Мотонейроны, иннервирующие одну мышцу, составляют общий мотонейронный пул, в котором могут находиться мотонейроны различных размеров. Большие ДЕ образованы крупными мотонейронами, которые имеют толстые аксоны, множество концевых разветвлений и большое число связанных с ними мышечных волокон. Такие ДЕ имеют низкую возбудимость, генерируют высокую частоту нервных импульсов (порядка 20-50 импульсов в 1с) и характеризуются высокой скоростью проведения возбуждения. Они включаются в работу лишь при высоких нагрузках на мышцу. Мелкие ДЕ имеют мотонейроны небольших размеров, тонкие и медленно проводящие аксоны, малое число мышечных волокон. Они легко возбудимы и включаются в работу при незначительных мышечных усилиях. Нарастание нагрузки вызывает активацию различных ДЕ скелетной мышцы в соответствии с их размерами — от меньших к большим (правило Хеннемана).

Мышечное волокно представляет собой вытянутую клетку (ее диаметр около 10-100 мкм, а длина 10-12 см). В состав волокна входят его оболочка — сарколемма, жидкое содержимое — саркоплазма, ядро, энергетические центры —митохондрии, белковые депо — рибосомы, сократительные элементы — миофибриллы, а также замкнутая система продольных трубочек и цистерн, расположенных вдоль миофибрилл и содержащих ионы Са,— саркоплазлштический ретикулум. Поверхностная мембрана клетки через равные промежутки образует поперечные трубочки, входящие внутрь мышечного волокна, по которым внутрь клетки проникает потенциал действия при ее возбуждении.

Тема №12567 Ответы к тестам по биологии 9 тем 810 вопросов (Часть 1)

Тема №12567

Тема 1. Клетка – структурная и функциональная единица живого
Тест 1
А1. 1. Назовите структурный компонент, который имеется в РНК, но отсутствует в
ДНК:
1) тимин
2) дезоксирибоза
3) рибоза
4) гуанин
А2. 1. К какой группе веществ относится рибоза:
1) белок
2) жир
3) углевод
4) фермент
А3. 1. В каких органеллах клетки находятся рибосомы:
1) шероховатом ЭР, митохондриях, пластидах
2) гладком ЭР, митохондриях, пластидах
3) ядерной оболочке, митохондриях, пластидах
4) шероховатом ЭР, гладком ЭР, митохондриях, пластидах
А4. 1. Какие функции выполняет в клетке ядро:
1) осуществляет сборку молекул белка
2) передачу наследственной информации
3) участвует в окислении органических веществ
4) осуществляет синтез углеводов из неорганических веществ
А5. 1. Группа веществ, производных высших карбоновых кислот, которая влияет
на проницаемость клеток и активность многих ферментов:
1) белки
2) нуклеиновые кислоты
3) углеводы
4) липиды
А6. 1. Клетки прокариот, так же как и клетки эукариот, имеют:
1) митохондрии
2) плазматическую мембрану
3) клеточный центр
4) пищеварительные вакуоли
А7. 1. Какие вещества входят в состав клеточной мембраны:
1) белки и фосфолипиды
2) белки и жирные кислоты
3) углеводы и глицерин
4) белки и углеводы
А8. 1. В клетках эукариот ДНК находится в: а) ядре, б) лизосомах, в) хлоропластах,
г) клеточном центре, д) митохондриях, е) аппарате Гольджи:
1) а, б, д, е
2) а, в, д
3) только а и д
4) только а и г
А9. 1. Укажите группу химических элементов, процентное содержание которых в
клетке преобладает:
1) H, O, S, P
2) H, C, O, N
3) N, P, H, O
4) C, H, K, Fe
А10. 1. Назовите нуклеиновую кислоту, количество которой в неделящейся клетке
постоянно:
1) ДНК
2) иРНК
3) тРНК
4) рРНК
Закончите фразу:
В1. 1. Составная часть родопсина, пигмента, находящегося в клетках сетчатки
глаза – это … .
В2. 1. Назовите свойство, присущее аминокислотам благодаря наличию в их
молекуле амино- и карбоксильных групп … .
В3. 1.Молекулы некоторых веществ, взаимодействующие с ферментом,
снижающие или блокирующие его активность называются … .
В4. 1. Установите соответствие между химическими макроэлементами и их
значением в метаболизме клетки:
Химический макроэлемент Значение
А) азот
Б) калий
В) хлор
1) Участвует в процессе фотосинтеза
2) Участвует в генерации
биоэлектрических потенциалов
3) Компонент соляной кислоты в
желудочном соке
4) Входит в состав хлорофилла
5) Входит в состав витаминов
6) Повышает активность ферментов
белкового синтеза
Запишите в таблицу буквы выбранных ответов.
1 2 3 4 5 6
В5. 1. Установите соответствие между физическими свойствами воды и их
значением в живых организмах:
Физические свойства воды Примеры
А) вязкость
Б) хороший растворитель
В) поверхностное натяжение
1) Кровь, тканевая жидкость,
желудочный сок
2) Синовиальная жидкость
3) Капиллярный кровоток
4) Клеточный сок у растений
5) Восходящий и нисходящий токи у
растений
6) Плевральная жидкость
Запишите в таблицу буквы выбранных ответов.
1 2 3 4 5 6

Тест 2
А1. 1. К простым углеводам относится:
1) гликоген
2) глюкоза
3) клетчатка
4) крахмал
А2. 1. Процесс выведения веществ из клетки через комплекс Гольджи,
происходящий в результате слияния мембранного мешочка с клеточной мембраной
и изливания его содержимого наружу:
1) экзоцитоз
2) эндоцитоз
3) облегченная диффузия
4) активный транспорт
А3. 1. Кристы митохондрий представляют собой:
1) зерна в матриксе
2) впячивание внутренней мембраны
3) гранулы между внутренней и наружной мембранами
4) впячивания наружной мембраны
А4. 1. Гены, кодирующие рРНК, находятся в области:
1) центромеры
2) центриоли
3) ядрышкого организатора
4) хромомеры
А5. 1. Синтез липидов в клетке осуществляется :
1) в митохондриях
2) на гладкой ЭПС
3) в центральной вакуоли
4) на гранулярной ЭПС
А6. 1. Опорный полисахарид клеточных стенок растений, некоторых
одноклеточных, схожий с веществом, образующим оболочку некоторых животных
(асцидий), построенный из 1, 4 – связанных остатков β – D – глюкозы:
1) крахмал
2) хитин
3) гемицеллюлозы
4) клетчатка
А7. 1. Центром организации микротрубочек является:
1) базальные тельца и
центриоли
2) промежуточные филаменты
3) микрофиламенты
4) центромеры
А8. 1. Полный оборот двойной спирали ДНК составляет:
1) 16 пар нуклеотидов
2) 20 пар нуклеотидов
3) 5 пар нуклеотидов
4) 10 пар нуклеотидов
А9. 1. β – структура белка – это:
1) третичная структура
2) вторичная структура
3) первичная структура
4) четвертичная структура
А10. 1. Диктиосомы являются структурной единицей:
1) аппарата Гольджи
2) ЭПС
3) лизосом
4) ядерной мембраны
Закончите фразу:
В1. 1. Органоид клеток животных и грибов, осуществляющий внутриклеточное
пищеварение. Представляет собой окруженный одинарной мембраной пузырек,
содержащий как в матриксе, так и в мембране набор гидролитических ферментов,
активных в слабокислой среде. Это — … .
В2. 1. Альдозы или кетозы, углеродная цепь которых содержит 3 и более атомов
углерода. Может существовать в ациклической и циклической формах. Это — … .
В3. 1. Гликопротеидный (также гликолипидный) комплекс, включенный в
наружную поверхность плазматической мембраны в животных клетках – это … .
В4. 1. Установите соответствие между химическими макроэлементами и их
значением в метаболизме клетки:
Химический макроэлемент Значение
А) железо
Б) сера
В) фосфор
1) входит в состав инсулина
2) входит в состав гема
миоглобина
3) входит в состав витамина В1
4) входит в состав костной ткани
5) входит в состав фосфатной
буферной системы у
млекопитающих
6) входит в состав метионина
Запишите в таблицу буквы выбранных ответов.
1 2 3 4 5 6
В5. 1. Установите соответствие между группами моносахаридов и примеров
моносахаридов:
Группы моносахаридов Название
А) триозы
Б) пентозы
В) гексозы
1) рибулоза
2) дезоксирибоза
3) глицериновый альдегид
4) рибоза
5) фруктоза
6) глюкоза
Запишите в таблицу буквы выбранных ответов.
1 2 3 4 5 6

Тест 3
А1. 1. Вторичная структура белка поддерживается:
1) пептидными связями
2) водородными связями
3) дисульфидными
ковалентными связями
4) ионными связями
А2. 1. Гормональную функцию могут выполнять:
1) только белки
2) белки и липиды
3) белки, липиды, углеводы
4) липиды, углеводы
А3. 1. Укажите аминокислоту, радикал которой содержит SН-группу:
1) валин
2) цистеин
3) тирозин
4) аланин
А4. 1. Какое химическое соединение играет большую роль в поддержании
осмотического давления в клетке:
1)
H O2
2) АТФ
3) NаСl
4) АДФ
А5. 1. Структура белковой молекулы, сохраняющаяся благодаря наличию
разнообразных связей (ковалентных полярных, неполярных, ионных), и
представляющая собой трехмерную пространственную упаковку полипептидной
цепи:
1) первичная структура белка
2) третичная структура белка
3) вторичная структура белка
4) четвертичная структура белка
А6. 1. При ренатурации происходит:
1) восстановление нативной структуры белка
2) частичное нарушение ес

Тественной структуры белка
3) необратимое нарушение нативной структуры белка
4) разрушение первичной структуры белка
А7. 1. В состав ферментов могут входить небелковые компоненты. При этом
белковая часть называется:
1) кофактор
2) кофермент
3) апофермент
4) коэнзим
А8. 1. Укажите гидрофильное вещество:
1) холестерин
2) дезоксирибоза
3) гликоген
4) хитин
А9. 1. Назовите вид химической связи, с помощью которой аминокислоты в
первичной структуре белка соединены друг с другом:
1) водородная
2) ионная
3) ковалентная
4) гидрофобная
А10. 1. При окислении каких веществ освобождается больше энергии:
1) глюкозы
2) крахмала
3) белков
4) жиров
Закончите фразу:
В1. 1. Гидростатическое давление, которое нужно приложить к избирательно
проницаемой мембране, отделяющей раствор от чистой воды, чтобы предотвратить
поступление воды в раствор называется … .
В2. 1. Вид ковалентной связи, возникающей в результате взаимодействия α-
аминогруппы ( Nh3
) одной аминокислоты с α-карбоксильной группой ( COOH
)
другой аминокислоты называется … .
В3. 1. Бесцветные мелкие пластиды округлой формы с очень простым строением,
находящиеся в растительной клетке, образованные из пропластид, и выполняющие
различные функции называются … .
В4. 1. Установите соответствие между углеводами и их значением
в метаболизме клетки:
Углевод Значение
А) целлюлоза
Б) гликоген
В) крахмал
1) резервный полисахарид
цианобактерий
2) резервный полисахарид
растительных клеток
3) резервный полисахарид
бактерий
4) структурный полисахарид
растений
5) самое распространенное
вещество на Земле
6) резервный полисахарид
грибов
Запишите в таблицу буквы выбранных ответов.
1 2 3 4 5 6
В5. 1. Установите соответствие между функцией белков и их названием:
Функция белков Примеры
А) защитная
Б) рецепторная
В) ферментативная
Г) пищевая
1) опсин
2) фитохром
3) гидролазы
4) казеин
5) изомеразы
6) лиазы
7) интерферон
8) каталаза
Запишите в таблицу буквы выбранных ответов.
1 2 3 4 5 6 7 8

Тест 4
А1. 1. Кинетохор — это:
1) белок хроматина, соединенный с молекулами ДНК
2) первичная перетяжка хромосомы
3) набор хромосом соматической клетки
4) фибриллярное тельце хромосомы, расположенное в области центромеры
А2. 1. Ученые, которые предложили модель двойной спирали ДНК:
1) Д. Уотсон, Ф. Крик
2) Г. де Фриз, К. Корренс, Э. Чермак
3) Р. Мишер, Н.К. Кольцов
4) Э. Чаргафф, М. Уилкинс, Р. Франклин
А3. 1. Ученый, который первым открыл крупные бактерии, одноклеточные
организмы, сперматозоиды, эритроциты:
1) Р. Гук
2) Р. Вирхов
3) А. Левенгук
4) К. Бэр
А4. 1. Белки, способные ускорять химические реакции, выполняют в клетке
функцию:
1) гормональную
2) сигнальную
3) ферментативную
4) регуляторную
А5. 1. Специфичность аминокислот определяется:

1) радикалом
2) аминогруппой
3) типом пептидных связей
4) числом связей с другими аминокислот
А6. 1. Из перечисленных химических соединений укажите азотистые основания:
1) глицин, урацил, аланин
2) тимин, аденин, лизин
3) урацил, гуанин, аденин
4) триптофан, цитозин, миозин
А7. 1. Назовите клетки, в которых накапливаются углеводы:
1) нервные клетки
2) клетки печени
3) эритроциты
4) клетки эпителия кожи
А8. 1.Существует явление, когда имеет место пространственное соответствие
участков молекул одних белков участкам молекул других белков. Укажите пару
белков, в которых отсутствует такое соответствие:
1) инсулин и рецептор инсулина
2) белки оболочки вируса и антитела к этим белкам
3) белок и фермент, разрушающий этот белок
4) гемоглобин и миоглобин
А9. 1. Нуклеотиды в одной нити молекулы ДНК соединяются следующим типом
связи:
1) ковалентной
2) водородной
3) сульфидной
4) пептидной
А10. 1. Пластиды, которые накапливают крахмал – это:
1) хлоропласты
2) амилопласты
3) этиопласты
4) элайопласты
Закончите фразу:
В1. 1. Процесс, при котором специальные мембранные белки-переносчики избирательно
связываются с тем или иным ионом или молекулой и переносят их через мембрану по
градиенту концентрации, называется … .
В2. 1. Микротрубочки, микрофиламенты и микротрабекулярная система образуют
внутриклеточный … .
В3. 1. Центриолям по структуре идентичны органеллы, которые обнаруживаются в
основании жгутиков и ресничек. Это … … .
В4. 1. Установите соответствие между названием структуры и ее характеристикой:

Название структуры Характеристика
А) нуклеотид
Б) нуклеозид
В) нуклеоид
1) кольцевая ДНК
2) состоит из азотистого основания и
пентозы дезоксирибозы
3) соединяются в цепь за счет остатков
фосфорной кислоты
4) аденин, гуанин, тимин, цитозин,
урацил
5) АТФ
6) альтернатива ядра у прокариот
Запишите в таблицу буквы выбранных ответов.
1 2 3 4 5 6
В5. 1. Установите соответствие между органеллами и их характеристиками:
Органеллы Функции
А) лейкопласты
Б) хлоропласты
В) хромопласты
1) образуются из пропластид или
лейкопластов
2) на свету преобразуются в хлоропласты
3) в осенних листьях содержат каротиноиды
4) служат местом образования крахмальных
зерен
5) придают окраску цветкам
6) органеллы фотосинтеза
Запишите в таблицу буквы выбранных ответов.
1 2 3 4 5 6

Тест 5
А1. 1.Назовите белок, выполняющий ферментативную функцию:
1) фибрин
2) инсулин
3) актин
4) трипсин
А2. 1. Какие из перечисленных аминокислот являются незаменимыми для человека: а)
глицин, б) пролин, в) валин, г) лизин, д) серин, е) треонин:
1) а, в, г
2) б, д, е
3) в, г, е
4) в, г, д
А3. 1. Чем обусловлена субстратная специфичность фермента:
1) комплементарностью активного центра фермента молекуле субстрата
2) размерами молекулы фермента
3) наличием кофермента
4) влиянием активатора

А4. 1. Единую транспортную систему клетки составляют:
1) ЭПС, митохондрии, лизосомы
2) аппарат Гольджи, клеточная мембрана, вакуоли
3) ЭПС, аппарат Гольджи, лизосомы
4) ЭПС, рибосомы, клеточная мембран
А5. 1. Специфичность групповым веществам крови придают:
1) белки 2) углеводы
3) липиды 4) нуклеиновые кислоты
А6. 1. В состав клеточной стенки грамположительных бактерий входят:
1) карбоновые кислоты
2) пептидогликан
3) камеди
4) хитин
А7. 1. Укажите, какие вещества защищают растения от поедания животными:
1) пектины
2) гликозиды
3) гемицеллюлозы
4) крахмал
А8. 1. В состав миелиновой оболочки аксона входят:
1) фосфолипиды
2) сфинголипиды
3) терпены
4) стероиды
А9. 1. В подкожной жировой клетчатке млекопитающих, впадающих в спячку,
откладывается:
1) простые липиды
2) холестерин
3) бурый жир
4) липопротеины
А10. 1. Кислород и углекислый газ в крови многих беспозвоночных переносит:
1) глобулин
2) гемоцианин
3) гемоглобин
4) цитохром
Закончите фразу:
В1. 1. Класс ферментов, катализирующих реакции гидролиза, т.е. расщепления
органических соединений с присоединением по месту разрыва элементов молекулы воды
называют … .
В2. 1. Процесс поглощения клеткой жидкости в виде мелких капель с растворенными в
них высокомолекулярными веществами, который осуществляется путем захвата этих
капель выростами цитоплазмы, называется … .
В3. 1. Внутреннее гидростатическое давление, направленное на клеточную стенку – это
В4. 1. Установите соответствие между видами РНК и их признаками:
Виды РНК Признаки
А) иРНК
Б) рРНК
В) тРНК
1) образует комплекс с рибосомами
2) составляет 80% всей РНК клетки
3) синтезируется в области вторичной
перетяжки ядрышковой хромосомы
4) переносит аминокислоты к рибосомам
5) переносит информацию с ДНК на белок
6) структурный компонент рибосом
7) составляет примерно 10% от всей
клеточной РНК
Запишите в таблицу буквы выбранных ответов.
1 2 3 4 5 6 7
В5. 1. Внешнее давление, которое влияет на движение воды и вызывается стремлением
молекул воды пройти сквозь полупроницаемую мембрану – это … … .

Тест 6
А1. 1. Транспорт веществ белками-переносчиками через плазмалемму по градиенту
концентрации:
1) эндоцитоз
2) облегченная диффузия
3) осмос
4) активный транспорт
А2. 1. При какой температуре молекулы воды образуют максимальное количество
водородных связей?
1) при нулевой
2) при температуре кипения
3) при минус пяти градусах
4) при плюс четырех градусах
А3. 1. Отмирание верхушечных почек, цветков, завязи происходит при недостатке:
1) фтора
2) марганца
3) кобальта
4) бора
А4. 1. Какое из ниже перечисленных веществ является гетерополисахаридом?
1) целлюлоза
2) хитин
3) гепарин
4) муреин
А5. 1. В состав жгутиков прокариот входит:
1) тубулин
2) альбумин
3) флагеллин
4) актин

А6. 1. Основу слизистых секретов составляет:
1) склеротин
2) мукопротеин
3) эластин
4) кератин
А7. 1. Универсальными противовирусными белками являются:
1) интерфероны
2) фитохромы
3) цитохромы
4) эластин
А8. 1. Негидролитическое присоединение или отщепление функциональных групп
осуществляют:
1) лигазы
2) лиазы
3) синтетазы
4) трансферазы
А9. 1. Третичная структура белка стабилизируется следующими связями:
1) только ковалентными
2) только водородными и ионными
3) только нековалентными
4) дисульфидными, водородными, гидрофобными и ионными
А10. 1. Концентрация ионов калия и натрия в клетке:
1) разная, ионов калия больше внутри клети, ионов натрия – снаружи
2) разная, ионов натрия больше внутри клетки, а ионов калия – снаружи
3) в одних случаях — одинаковая, в других – разная
4) всегда одинаковая
Закончите фразу:
В1. 1. Пластиды с желтой, оранжевой и красной окраской, встречающиеся в клетках
плодов, лепестков, в осенних листьях, реже в корнях (морковь), не имеющие
внутренней мембраны – это … .
В2. 1. Специфические белки, которые переносят через клеточную мембрану различные
полярные молекулы, ионы, сахара, аминокислоты, нуклеотиды и многие другие
метаболиты – это … … .
В3. 1. Класс ферментов, катализирующих обратимый перенос различных групп атомов
от молекул одних органических соединений (доноров) к другим (акцепторам)
называют … .
В4. 1. Транспорт веществ против градиентов их концентраций через полупроницаемую
мембрану называется … .
В5. 1. Способ проникновения внутрь клетки различных макромолекул, связанный с
мембранной упаковкой – это … .

Тема 1. Клетка – структурная и функциональная единица живого
Тест 1
Номер задания Ответ
А1. 1 3
А2. 1 3
А3. 1 1
А4. 1 2
А5. 1 4
А6. 1 2
А7. 1 1
А8. 1 2
А9. 1 2
А10. 1 1
В1. 1 Опсин
В2. 1 Амфотерность
В3. 1 Ингибиторами
В4. 1 1Б2Б3В4А5А6Б
В5. 1 1Б2А3В4Б5В6А

Тест 2
Номер задания Ответ
А1. 1 2
А2. 1 1
А3. 1 2
А4. 1 3
А5. 1 2
А6. 1 4
А7. 1 1
А8. 1 4
А9. 1 2
А10. 1 1
В1. 1 Лизосома
В2. 1 Моносахариды
В3. 1 Гликокаликс
В4. 1 1Б2А3Б4В5В6Б
В5. 1 1Б2Б3А4Б5В6В

Тест 3
Номер задания Ответ
А1. 1 2
А2. 1 2
А3. 1 2
А4. 1 3
А5. 1 2
А6. 1 1
А7. 1 3
А8. 1 2
А9. 1 3
А10. 1 4
В1. 1 Осмотическим
В2. 1 Пептидной
В3. 1 Лейкопласты
В4. 1 1Б2В3Б4А5А6Б
В5. 1 1Б2Б3В4Г5В6В7А8В

Тест 4
Номер задания Ответ
А1. 1 4
А2. 1 1
А3. 1 3
А4. 1 3
А5. 1 1
А6. 1 3
А7. 1 2
А8. 1 4
А9. 1 1
А10. 1 2
В1. 1 Облегченная
диффузия
В2. 1 Цитоскелет
В3. 1 Базальные тельца
В4. 1 1В2Б3А4А5А6В
В5. 1 1Б2А3В4А5В6Б

Тест 5
Номер задания Ответ
А1. 1 4
А2. 1 3
А3. 1 1
А4. 1 3
А5. 1 2
А6. 1 2
А7. 1 2
А8. 1 2
А9. 1 3
А10. 1 2
В1. 1 Гидролазами
В2. 1 Пиноцитозом
В3. 1 Тургор
В4. 1 1А2Б3Б4В5А6Б7В
В5. 1 Осмотический
потенциал

Тест 6
Номер задания Ответ
А1. 1 2
А2. 1 4
А3. 1 4
А4. 1 3
А5. 1 3
А6. 1 2
А7. 1 1
А8. 1 2
А9. 1 4
А10. 1 1
В1. 1 Хромопласты
В2. 1 Белки-переносчики
В3. 1 Трансферазами
В4. 1 Активным
В5. 1 Эндоцитоз

Проверочная работа 9 класс Строение клетки. 2 варианта. С ответами.

Вариант 1.

В каких структурах растительной клетки накапливается крахмал:

А. митохондрии

б. хлоропласты

с. лейкопласты

д. вакуоли.

Е. ЭПС.

2. Какие структуры участвуют в клеточном дыхании:

А. рибосомы

б. аппарат Гольджи

с. пластиды

д. митохондрии

е. ядро.

3. Кариоплазма – это:

А. совокупность нуклеотидов

б. генетический материал бактерий

с. комплекс ДНК и белков

. д. ядерный сок

е. ядерная мембрана.

4. Каковы функции ядра:

А. хранение и передача наследственной информации

б. участие в делении клеток

С. участие в биосинтезе белка

д. синтез ДНК и РНК.

Е. все перечисленное.

5. Какова функция нуклеиновых кислот в клетке:

А. хранение и передача наследственной информации

б. участие в делении клеток

С. участие в биосинтезе белка

д. синтез ДНК и РНК.

Е. все перечисленное.

6. Роль липидного слоя в функционировании биологических мембран:

А. избирательная проницаемость.

Б. непроницаемость.

С. полная проницаемость.

Д. проницаемость только для крупных молекул.

Е. проницаемость только для воды

7. Кто впервые ввел термин «фагоцитоза»:

А. Р.Гук.

б. Р.Броун.

С. Л. Пастер

Д. И.И. Мечников

Е. Ф .Туорт.

8.В каких органоидах синтезируются белки:

А. хлоропласты.

Б. рибосомы.

С. митохондрии

Д. ЭПС.

Е. ядро.

9. С какой из структур ядра связано образование всех видов РНК:

А. ядерная оболочка

Б. ядрышко

С. хромосомы.

Д. ядерный сок.

Е. ядерные поры.

10. С появлением какой структуры ядро обособилось от цитоплазмы:

А. ядерная оболочка

Б. ядрышко

С. хромосомы.

Д. ядерный сок.

Е. ядерные поры.

11. Какая ядерная структура несет наследственные свойства:

А. ядерная оболочка

Б. ядрышко

С. хромосомы.

Д. ядерный сок.

Е. ядерные поры.

12. Почему митохондрии называют энергетическими станциями клеток:

А. осуществляют синтез белка.

Б. синтез АТФ

С. синтез углеводов.

Д. расщепление АТФ.

Е. синтез липидов.

13. Органоид, имеющий дойную мембрану:

А. вакуоль.

Б. митохондрии.

С. лизосомы.

Д. аппарат Гольджи.

Е. рибосомы.

14. Какие структурные элементы характерны для всех клеток:

А. митохондрии.

Б. пластиды.

С. жгутики.

Д. микротрубочки.

Е. бактериофаги.

15. Каково строение липидного слоя мембраны клетки:

А. мономолекулярный.

Б. непрерывный.

С. прерывный.

Д. белковый.

Е. бимолекулярный

16. Полужидкое вещество, заполняющее всю клетку, в котором расположены органоиды и ядро:

А. кариоплазма.

Б. плазма.

С. цитоплазма.

Д. целлюлоза.

Е. протоплазма.

17. Как называется тонкий внешний покров клетки и некоторых органоидов, состоящий из молекул липидов и белков:

А. эктодерма.

Б. мембрана.

С. оболочка.

Д. гликокаликс.

Е. энтодерма.

18. Органоид, связывающий клетку в единое целое, осуществляющий транспорт веществ, участвующий в синтезе белков:

А. клеточная мембрана.

Б. комплекс Гольджи.

С. эндоплазматическая сеть.

Д. рибосомы.

Е. митохондрии.

19. Как называются внутренние складки митохондрий:

А. граны.

Б. матрикс.

С. кристы.

Д. строма.

Е. тилакоиды.

20. Что расположено на наружной поверхности мембран ЭПС:

А. вакуоли.

Б. фагосомы

С. рибосомы.

Д. пластиды.

Е. жгутики.

21. Какие органоиды имеют одномембранное строение:

А. митохондрии.

Б. пластиды.

С. лизосомы.

Д. рибосомы.

Е. жгутики.

22. Органоиды движения простейших организмов:

А. жгутики

Б. выросты.

С. трубочки.

Д. центриоли. Е. вакуоли.

23. Какой органоид есть только в растительной клетке:

А. митохондрии.

Б. пластиды.

С. лизосомы.

Д. рибосомы.

Е. жгутики.

24. Первичные организмы-прокариоты:

А. улотрикс.

Б. вирус гриппа.

С. мукор.

Д. молочнокислые бактерии.

Е. эвглена-зеленая.

25. Придает привлекательный вид для насекомых лепесткам цветов:

А. хлоропласты.

Б. лейкопласты.

С. хромопласты.

Д. хромосомы.

Е. Вакуоли.

26. Выберите характеристику эукариотической клетки:

А. содержит ядро.

Б. отсутствует наследственный материал .

С. носителем наследственности служит молекула РНК.

Д. все эукариоты многоклеточны.

Е. одноклеточные организмы.

27. Пиноцитоз является функцией:

А. клеточной мембраны.

Б. ЭПС.

С. комплекса Гольджи.

Д. лизосом.

Е. рибосом.

28. К эукариотам относятся:

А. амебы.

Б. бактерии.

С. вирусы.

Д. бактериофаги.

Е.прокариоты.

29. Какой компонент клетки участвует в процессе фотосинтеза:

А. ядро.

Б. митохондрии.

С. пластиды.

Д. лизосомы.

Е. рибосомы.

30. Неизлечимая болезнь, вызываемая вирусом и передающаяся от человека к человеку половым путем:

А. гайморит.

В. тиф.

С. СПИД.

Д. цистит.

Е. грипп

В1. Закончите следующие фразы:

А) Синтез запасов АТФ клетки происходит в_______________

Б) фотосинтез осуществляется в_______________

В) Биосинтез белка происходит на ______________

Г) Избирательный транспорт веществ осуществляет__________

В2. Установите соответствие между органоиды клетки и их функциями.

ФУНКЦИИ ОРГАНОИДЫ КЛЕТКИ

1) Ядро; 2)Митохондрии.

А) Имеет двумембранную оболочку с порами

Б) Хранит наследственную информацию и участвует в ее передаче

В) Содержит ядрышко, в котором собираются рибосомы

Г) Содержат множество ферментов, участвующих в синтезе АТФ

Д) Отвечает за синтез АТФ

Е) Содержи кариоплазму

С1 Дайте полный развернутый ответ.

Объясните, каковы функции митохондрий в клетке.

2 вариант.

1. Кто впервые ввел термин «фагоцитоза»:

А. Р.Гук.

б. Р.Броун.

С. Л. Пастер

Д. И.И. Мечников

Е. Ф .Туорт.

2. Какой органоид есть только в растительной клетке:

А. митохондрии.

Б. пластиды.

С. лизосомы.

Д. рибосомы.

Е. жгутики.

3. Кариоплазма – это:

А. совокупность нуклеотидов

б. генетический материал бактерий

с. комплекс ДНК и белков

д. ядерный сок

е. ядерная мембрана.

4. Роль липидного слоя в функционировании биологических мембран:

А. избирательная проницаемость.

Б. непроницаемость.

С. полная проницаемость.

Д. проницаемость только для крупных молекул.

Е. проницаемость только для воды

5. В каких структурах растительной клетки накапливается крахмал:

А. митохондрии

б. хлоропласты

с. лейкопласты

д. вакуоли.

Е. ЭПС.

6. Пиноцитоз является функцией:

А. клеточной мембраны.

Б. ЭПС.

С. Комплекса Гольджи.

Д. лизосом.

Е. рибосом

7. Что расположено на наружной поверхности мембран ЭПС:

А. вакуоли.

Б. фагосомы.

С. рибосомы.

Д. пластиды.

Е. жгутики.

8. Неизлечимая болезнь, вызываемая вирусом и передающаяся от человека к человеку половым путем:

А. гайморит.

В. тиф.

С. СПИД.

Д. цистит.

Е. грипп

9. Какова функция нуклеиновых кислот в клетке:

А. хранение и передача наследственной информации

б. участие в делении клеток

С. участие в биосинтезе белка

д. синтез ДНК и РНК.

Е. все перечисленное.

10. Какие структуры участвуют в клеточном дыхании:

А. рибосомы

б. аппарат Гольджи

с. пластиды

д. митохондрии

е. ядро.

11. Каковы функции ядра:

А. хранение и передача наследственной информации

б. участие в делении клеток

С. участие в биосинтезе белка

д. синтез ДНК и РНК.

Е. все перечисленное.

12. С появлением какой структуры ядро обособилось от цитоплазмы:

А. ядерная оболочка

Б. ядрышко

С. хромосомы.

Д. ядерный сок.

Е. ядерные поры.

13. Органоид, связывающий клетку в единое целое, осуществляющий транспорт веществ, участвующий в синтезе белков:

А. клеточная мембрана.

Б. комплекс Гольджи.

С. эндоплазматическая сеть.

Д. рибосомы.

Е. митохондрии.

14.В каких органоидах синтезируются белки:

А. хлоропласты.

Б. рибосомы

С. митохондрии

Д. ЭПС.

Е. ядро.

15. С какой из структур ядра связано образование всех видов РНК:

А. ядерная оболочка

Б. ядрышко

С. хромосомы.

Д. ядерный сок.

Е. ядерные поры.

16. Какой компонент клетки участвует в процессе фотосинтеза:

А. ядро.

Б. митохондрии.

С. пластиды.

Д. лизосомы.

Е. рибосомы.

17. Первичные организмы-прокариоты:

А. улотрикс.

Б. вирус гриппа.

С. мукор.

Д. молочнокислые бактерии.

Е. эвглена-зеленая.

18. Как называются внутренние складки митохондрий:

А. граны.

Б. матрикс.

С. кристы.

Д. строма

Е. тилакоиды.

19. Как называется тонкий внешний покров клетки и некоторых органоидов, состоящий из молекул липидов и белков:

А. эктодерма.

Б. мембрана.

С. оболочка.

Д. гликокаликс.

Е. энтодерма.

20. Органоиды движения простейших организмов:

А. жгутики.

Б. выросты.

С. трубочки.

Д. центриоли.

Е. вакуоли.

21. Выберите характеристику эукариотической клетки:

А. содержит ядро.

Б. отсутствует наследственный материал .

С. носителем наследственности служит молекула РНК.

Д. все эукариоты многоклеточны.

Е. одноклеточные организмы.

22. Придает привлекательный вид для насекомых лепесткам цветов:

А. хлоропласты

Б. лейкопласты.

С. Хромопласты

Д. хромосомы.

Е. Вакуоли.

23. Какая ядерная структура несет наследственные свойства:

А. ядерная оболочка

Б. ядрышко

С. хромосомы.

Д. ядерный сок.

Е. ядерные поры.

24. Какие структурные элементы характерны для всех клеток:

А. митохондрии.

Б. пластиды.

С. жгутики.

Д. микротрубочки

Е. бактериофаги.

25. Какие органоиды имеют одномембранное строение:

А. митохондрии.

Б. пластиды.

С. лизосомы.

Д. рибосомы.

Е. жгутики.

26. Почему митохондрии называют энергетическими станциями клеток:

А. осуществляют синтез белка.

Б. синтез АТФ.

С. синтез углеводов.

Д. расщепление АТФ.

Е. синтез липидов.

27. Органоид, имеющий двойную мембрану:

А. вакуоль

Б. митохондрии.

С. лизосомы.

Д. аппарат Гольджи

Е. рибосомы.

28. Полужидкое вещество, заполняющее всю клетку, в котором расположены органоиды и ядро:

А. кариоплазма.

Б. плазма.

С. цитоплазма.

Д. целлюлоза.

Е. протоплазма.

29. Каково строение липидного слоя мембраны клетки:

А. мономолекулярный.

Б. непрерывный.

С. прерывный.

Д. белковый

Е. бимолекулярный

30. К эукариотам относятся:

А. амебы.

Б. бактерии.

С. вирусы.

Д. бактериофаги

Е.прокариоты.

В1. Закончите следующие фразы:

А) Лейкопласты на свету превращаются в__________

Б) Органоидами движения являются______________

В) Набор хромосом, содержащийся в клетках того или иного организма получил название__________

Г) Синтез запасов АТФ осуществляется в органоиде_________________

В2. Установите соответствие между органоиды клетки и их функциями.

ФУНКЦИИ ОРГАНОИДЫ КЛЕТКИ

1) Рибосомы; 2) ЭПС

А) Участвует в транспорте и синтезе веществ

Б) Может быть гладкой или шероховатой

В) Состоит из двух субъединиц

Г) Образованы рибонуклеиновыми кислотами и белками

Д) Отвечает за синтез белков

Е) Есть у бактерий

С1 Дайте полный развернутый ответ.

Объясните, каковы функции ядра в клетке.

Ответы:

Вариант1

Вариант 2

1 вариант.

В1. 1. в митохондриях

2. в хлоропластах

3. на рибосомах

4. Клеточная стенка (оболочка)—участвует в поглощении и обмене ионов, через оболочку идет транспорт веществ. Цитоплазматическая мембрана или плазмалемма —- обеспечивает транспорт веществ

В2. А1 Б2 В1 Г1 Д2 Е2

2 вариант.

В1. А) хлоропласты

Б) реснички и жгутики

В) кариотип

Г) митохондриии

В2. Установите соответствие между органоиды клетки и их функциями.

ФУНКЦИИ

А) 2 Б) 2 В) 1 Г) 1 Д) 2 Е) 1

Органоиды для изучения кишечного транспорта питательных веществ, усвоения лекарств и метаболизма – обновление человеческой модели и расширение области применения

Abstract

Процессы кишечного транспорта и восприятия и их взаимосвязь с метаболизмом имеют отношение к таким патологиям, как синдромы мальабсорбции, воспалительные заболевания, ожирение и диабет 2 типа. Составляя высокоселективный барьер, эпителиальные клетки кишечника поглощают, метаболизируют и высвобождают питательные вещества в кровоток, таким образом, выполняя роль контролера доступности питательных веществ и метаболического здоровья для всего организма. Помимо транспорта питательных веществ и сенсорных функций, кишечные переносчики, включая переносчик пептидов 1 (PEPT1), участвуют в абсорбции лекарств и пролекарств, включая некоторые ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, ингибиторы протеазы, противовирусные препараты и пептидомиметики, такие как β-лактамные антибиотики. Здесь мы проверяем применимость 3D-органоидов для in vitro исследования кишечных биохимических процессов, связанных с транспортом и метаболизмом питательных веществ и лекарств. Создавая множество методологий, включая иллюстрацию опосредованного транспортером поглощения питательных веществ и лекарств, а также подходы к метаболомике, мы выделяем кишечные органоиды как надежный и надежный инструмент в этой области исследований.Используемые в настоящее время модели in vitro для изучения всасывания питательных веществ в кишечнике, транспорта лекарств и метаболизма энтероцитов, такие как клетки Caco-2 или модели эксплантов грызунов, имеют ограниченную ценность из-за их рака и нечеловеческого происхождения, соответственно. В частности, различия между видами приводят к плохой корреляции данных, и результаты, полученные в этих моделях, не могут быть надежно экстраполированы на человека, о чем свидетельствует высокая частота неудач в процессах разработки лекарств. Напротив, кишечные органоиды человека представляют собой превосходную модель кишечного эпителия и могут помочь реализовать принцип 3R (сокращение, уточнение и замена) в фундаментальной науке, а также в доклинических и нормативных условиях.

Ключевые слова: пептидомиметики , ацилкарнитин, абсорбция глюкозы, визуализация живых клеток, окисление жирных кислот, PEPT1, конкурентное ингибирование, 3R

Введение

С 2009 г., когда Sato et al. (2009) сообщили о создании и долгосрочном культивировании in vitro кишечных органоидов, эта технология оказала огромное влияние на исследования в области биологии стволовых клеток, фундаментальной медицинской науки, моделирования заболеваний и персонализированной медицины. Ранее мы сообщали об органоидах кишечника мышей для оценки транспорта и восприятия питательных веществ, а также секреции гормона инкретина (Zietek et al., 2015). Кишечные переносчики питательных веществ не только участвуют в абсорбции питательных веществ из проглоченной пищи, они также служат сенсорами, например, для секреции глюкагоноподобного пептида 1 (ГПП-1) и способны транспортировать определенные лекарства (Wenzel et al., 2002; Зитек и Даниэль, 2015 г.). Следовательно, кишечные транспортные процессы и их взаимосвязь с метаболизмом кишечных эпителиальных клеток (IEC) и метаболическим состоянием всего организма имеют отношение к различным заболеваниям и представляют собой потенциальные терапевтические мишени.К числу этих патологий относятся кишечные заболевания, такие как синдромы мальабсорбции и воспаление кишечника, а также метаболические нарушения, включая ожирение и диабет 2 типа, а также патологии, которые лечат лекарственными препаратами, которые активно всасываются и/или метаболизируются энтероцитами. Например, пептидомиметики, такие как β-лактамные антибиотики, являются субстратами переносчиков пептидов (Wenzel et al., 2002), а широкий спектр лекарств метаболизируется кишечными ферментами цитохрома P450 (Xie et al., 2016). Кроме того, IEC не только представляют собой барьер, отделяющий хозяина от его микробиоты, метаболизм эпителия служит привратником доступности питательных веществ для всего организма, а окисление IEC жирных кислот участвует в контроле приема пищи (Langhans et al., 2011; Рамачандран и др., 2018). Тем не менее, многие аспекты всасывания питательных веществ, биодоступности лекарств и метаболизма энтероцитов остаются неясными, например, основные причины мальабсорбции фруктозы до сих пор неизвестны (Ebert and Witt, 2016) и модель для прогнозирования влияния химических модификаций лекарств на их пероральную биодоступность. отсутствует (Ovadia et al., 2011; Rader et al., 2018b). Следовательно, растет интерес к модельным системам, позволяющим изучать всасывание питательных веществ в кишечнике, транспорт лекарств и метаболизм энтероцитов.

Здесь мы подтверждаем возможность переноса наших предыдущих исследований поглощения в мышиных кишечных органоидах (Zietek et al., 2015) на человеческие органоиды, улучшенные экспериментальные протоколы и расширенные показания для визуализации транспортных процессов и метаболических анализов. Существовавшие ранее модели in vitro , такие как клетки Caco-2, культура клеток почки собаки Madin-Darby (MDCK) или модели эксплантатов грызунов (камера Ussing, модели вывернутого кишечного мешка) имеют серьезные ограничения, поскольку они не отражают физиологию человека из-за к их раковому происхождению (Pinto et al., 1983; Hidalgo et al., 1989) или их нечеловеческого происхождения соответственно. Напротив, органоиды человека точно отражают эпителиальную физиологию в разрешении для конкретного региона, сохраняют фенотип донора и одновременно предлагают преимущества простоты обращения, длительного культивирования и размножения, а также криоконсервации (Almeqdadi et al., 2019). ). Поскольку видоспецифические различия препятствуют экстраполяции данных, полученных с помощью моделей животных, на человека, сосредоточение внимания на моделях исследований, основанных на человеке, имеет важное значение для получения релевантных для человека данных, связанных с болезнями и разработкой лекарств. В настоящее время кишечные органоиды в основном обсуждаются в контексте персонализированной медицины, позволяющей проводить индивидуализированный скрининг лекарств и прогнозировать реакцию на лекарства у онкологических больных и пациентов с муковисцидозом (Kondo and Inoue, 2019; Phan et al., 2019; Schutgens and Clevers, 2019). 2020). Однако органоиды в качестве превосходной модели кишечного эпителия могут дополнительно использоваться для базовых исследований биодоступности лекарств, разработки лекарств и токсикологических испытаний, дополняя и частично заменяя испытания на животных (Grabinger et al., 2014; Такахаши, 2019). Наши данные подтверждают, что уже простые протоколы культивирования органоидов обладают большим потенциалом в улучшении набора инструментов для метаболических исследований и облегчении подходов без использования животных.

Результаты

Влияние условий культивирования Органоидный клеточный состав и экспрессия переносчиков питательных веществ

Большая часть поглощения питательных веществ и минералов происходит в тонком кишечнике при посредничестве специфических переносчиков питательных веществ, расположенных в мембране щеточной каемки энтероцитов (Daniel and Zietek, 2015) . Ключевым свойством кишечных органоидов является то, что они внутренне запрограммированы на свою локализационно-специфическую функцию и сохраняют характеристики своего места происхождения в культуре (Middendorp et al., 2014). Следовательно, дифференциальная экспрессия генов, описанная как сайт-специфичная ( GATA4 , ABST , OSTB ) (Middendorp et al., 2014), а также натрий-протонного обменника (NHE)3 и эпителиального натрия канал (ENaC) , участвующий в эпителиальных транспортных процессах в тонкой и толстой кишке, соответственно, может быть обнаружен в органоидах человека, происходящих из разных сегментов кишечника ().Соотношение экспрессии мРНК NHE3 и ABST в органоидах дуоденального и подвздошного происхождения отражало соотношение, наблюдаемое в первичных тканях, используемых для выделения крипт, подчеркивая физиологическую значимость (дополнительная фигура 1A). В линии экспрессия мРНК энтероцитарного маркера кишечной щелочной фосфатазы ( ALPI ), а также основного апикального переносчика глюкозы, натрий-глюкозного котранспортера ( SGLT ) 1, переносчика глюкозы ( GLUT ) 2, опосредующего глюкозу и фруктозу потоки на базолатеральной мембране посредством облегченной диффузии, апикальный переносчик фруктозы GLUT5 и переносчик пептидов 1 ( PEPT1 ) наблюдались в человеческих органоидах, полученных из различных областей (двенадцатиперстной кишки, тощей кишки, подвздошной кишки) тонкой кишки (дополнительная фигура 1B) . Экспрессия SGLT1 и PEPT1 также может быть обнаружена в органоидах толстой кишки человека (дополнительная фигура 1B), а хромогранин A ( CHGA ), маркер энтеродендокринных клеток (EEC), был экспрессирован во всех исследованных сегментах кишечника (дополнительная фигура 1B). ). Зрелые, дифференцированные энтероциты являются необходимым условием для изучения транспортных процессов, нижестоящей передачи сигналов и метаболических ответов. Однако среды для культивирования кишечных органоидов, в том числе коммерческие готовые к использованию среды, оптимизированные для постоянного размножения органоидов человека, содержат факторы Wnt и определенные ингибиторы, которые сохраняют эпителиальные клетки в недифференцированном состоянии, подобном стволовым клеткам (Lindeboom et al., 2018). Соответственно, уровни мРНК исследованных генов значительно снижались после первого пассажа органоидов (). Во время расширенной культуры (пассажи с 4 по 8) экспрессия оставалась стабильной на низких уровнях (дополнительная фигура 1C). В частности, экспрессия мРНК GCG , кодирующего и.а. глюкагоноподобный пептид инкретинового гормона 1 (GLP-1) в EEC быстро терялся. В то время как в органоидах тонкой кишки, отобранных после второго пассажа, они полностью не обнаруживались, уровни экспрессии были значительно снижены в органоидах, полученных из толстой кишки.Дифференцировку органоидов можно направить на образование отдельных подтипов кишечных эпителиальных клеток (IEC), таких как EEC (Petersen et al., 2015) или клеток микроскладок (M) (de Lau et al., 2012), путем добавления определенных модуляторов, таких как γ-секретаза. ингибитор или RANKL. И наоборот, , удаление соединений, таких как Wnt3a или R-Spondin1, приводит к общим процессам дифференцировки в направлении линии энтероцитов (Foulke-Abel et al., 2016; Lindeboom et al., 2018). В свою очередь, изменение среды для выращивания органоидов с имеющейся в продаже среды, подходящей для длительного культивирования человеческих органоидов (человеческие IC (hIC), которая содержит недоступные концентрации факторов роста и ингибиторов) на стандартную среду, используемую для мышиных малых культура кишечных органоидов (среда для культивирования крипт, CCM), содержащая эпидермальный фактор роста (EGF), Noggin1 и R-Spondin1, но без факторов Wnt, индуцированные уровни экспрессии ALPI , SGLT1 , GLUT2 , GLUT5 , PEPT1 , CHGA и SPINK1 (). SPINK1 обладает структурным сходством с EGF и связан с воспалительными состояниями и различными видами рака, такими как хронический панкреатит (Hasan et al., 2018), воспалительное заболевание кишечника и рак толстой кишки (Ida et al., 2015). Вестерн-блот анализ экспрессии белков SGLT1 и PEPT1 подтвердил индукцию, наблюдаемую на уровнях мРНК (12). Аналогичный подход к мышиным тонкокишечным органоидам, сравнивая среду CCM и мышиной IC (mIC), дал согласованные результаты (дополнительная фигура 1D), подчеркнув важность соответствующих условий культивирования для функциональных показателей, таких как транспортные анализы или секреция инкретинового гормона в культурах кишечных органоидов.

Условия культивирования влияют на состав кишечных органоидных клеток и экспрессию переносчиков питательных веществ. (A) Анализы экспрессии мРНК человеческих органоидов, полученных из различных сегментов кишечника; изображены сайт-специфические гены (пассаж p0) (B) Схематическое представление органоидной культуры, из которой были получены образцы для анализа. (C,D) Анализ экспрессии мРНК органоидов двенадцатиперстной кишки человека из пассажей p0 и p2. (E) Уровни экспрессии мРНК GCG в органоидах человека, полученных из различных сегментов кишечника из пассажей p0 и p2. (C–E) Экспрессия гена-мишени нормализована до HPRT . (F) Верхняя панель: схематическое изображение экспериментальной установки, из которой были получены образцы для анализа экспрессии мРНК; нижняя панель: относительная экспрессия генов органоидов двенадцатиперстной кишки человека, культивируемых в CCM, как кратность органоидов, культивируемых в среде hIC, содержащей Wnt. HPRT использовался как экономка. Столбцы представляют среднее значение + SEM. (G) Экспрессия белков SGLT1 и PEPT1 в органоидах человека, культивируемых в среде hIC и CCM в течение 5 дней соответственно.β-ACTIN служит для контроля нагрузки. (A,F) непарных t-тестов ( n = 5–6). (C–E) парных t-тестов ( n = 5–6). Звездочками отмечены достоверные различия * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001; НД = не обнаруживается; нс = несущественный; hIC = человеческая среда IntestiCult, CCM = среда для культивирования крипт.

Транспорт питательных веществ и лекарств в кишечных органоидах человека

Простые сахара могут поглощаться энтероцитами путем пассивного или активного транспорта и таким же образом покидать энтероцит.Механизм всасывания сахара в кишечнике до сих пор полностью не ясен, учитывая, что в него вовлечено множество переносчиков семейства котранспортеров глюкозы натрия (SGLT) и семейства облегчающих переносчиков глюкозы (GLUT) с частично неизвестной специфичностью (Thorens and Mueckler, 2010). Генетические варианты транспортеров, участвующих в кишечном транспорте сахара, связаны с заболеваниями человека, такими как мальабсорбция глюкозы-галактозы и синдром Фанкони-Биккеля, вызванные мутациями в SGLT1 ( SLC5A1 ) и GLUT2 ( SLC2A2 ) соответственно (Martin et al. , 1996; Сантер и др., 1997). В частности, повышенное внимание уделяется потреблению фруктозы, поскольку потребление фруктозы растет за последние десятилетия и связано с развитием сердечно-сосудистых заболеваний и диабета 2 типа (Johnson et al., 2007). Кроме того, молекулярная основа мальабсорбции фруктозы все еще остается неясной, но наиболее вероятно нарушение абсорбции. Следовательно, кишечные органоиды, которые могут быть получены непосредственно от пациентов и позволяют представить сложное взаимодействие транспортеров, могут значительно продвинуть науку в этой области.

Ранее мы разработали простой подход к оценке транспорта питательных веществ и лекарств в кишечных органоидах мышей (Zietek et al., 2015). Используя флуоресцентно (FITC) меченные декстраны, мы смогли показать, что молекулы размером 4 кДа быстро достигают люминального компартмента мышиных органоидов. Следовательно, субстраты с радиоактивной меткой просто добавляли в чашки для культивирования, сохраняя органоиды в их трехмерной среде (купол геля, богатого ламинином) (Zietek et al. , 2015).Поскольку видоспецифические различия могут привести к вводящим в заблуждение результатам (Youhanna and Lauschke, 2020), мы утвердили экспериментальные процедуры для кишечных органоидов человека, что позволяет решать вопросы исследования, специфичные для человека. После подтверждения транслокации 4 кДа FITC-декстранов также в просвет человеческих органоидов (дополнительная фигура 2A) мы применили экспериментальные процедуры, установленные в мышиных кишечных органоидах (дополнительная фигура 2B), к человеческим органоидам. Сначала исследуя поглощение глюкозы и фруктозы, мы использовали различные ингибиторы для функциональной характеристики транспорта моносахаридов, ингибитор SGLT1 флоридзин, ингибитор GLUT флоретин и рубузозид, ингибирующие транспорт фруктозы с помощью GLUT5 (11).

Транспорт питательных веществ и лекарств в кишечных органоидах человека. (A) Схематическое изображение исследованных переносчиков и используемых ингибиторов. (B) Поглощение меченой радиоактивным изотопом глюкозы человеческими органоидами, полученными из различных сегментов тонкой кишки. (C) Поглощение радиоактивно меченной фруктозы органоидами двенадцатиперстной кишки человека. (D) Схематическое представление интактных органоидов и «разбитых» органоидов для измерения транспортной активности. (E) Слева: сравнение обнаруженных количеств на образец для обоих подходов с использованием одного и того же количества радиоактивно меченых субстратов и справа: снижение поглощения радиоактивно меченого Gly-Sar конкурентным ингибитором Gly-Gly, изображенное для обоих подходов. Снижение поглощения существенно не изменилось по сравнению с обоими подходами; Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим тестом Тьюки. (F) Химическая структура и формулы используемых пептидомиметиков. (G) Оценка транспорта пептидомиметиков в конкурентном анализе с использованием радиоактивно меченного Gly-Sar в органоидах тонкого кишечника мышей, полученных от мышей дикого типа и мышей с нокаутом Pept1. (H) Подход аналогичен (G) с использованием органоидов двенадцатиперстной кишки человека. (I) Снижение захвата радиоактивно меченого Gly-Sar с использованием антибиотика цефадроксила в качестве конкурентного ингибитора. (B,C) Непарные t-тесты с поправкой Уэлча. (E,I) Непарные t-тесты. Столбцы представляют среднее значение + SEM. (G,H) Односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом Тьюки. Для всех опытов n = 5–6. Звездочки указывают на существенные различия * P < 0.05, ** Р < 0,01, *** Р < 0,001.

Глюкоза является субстратом как для апикального, так и для базолатерального транспортеров GLUT, при этом электрогенный переносчик растворенного вещества SGLT1 является основным апикальным переносчиком глюкозы в тонкой кишке. GLUT5 представляет собой исключение, транспортируя исключительно фруктозу на апикальной мембране. Напротив, унипортер GLUT2 опосредует потоки глюкозы и фруктозы на базолатеральной мембране посредством облегченной диффузии, обеспечивая возможности как импорта, так и экспорта (Thorens and Mueckler, 2010; Roder et al. , 2014; ). Из-за экспериментальной установки субстраты сначала достигают внешней, т. е. базолатеральной стороны органоидов, и только впоследствии, после достижения просвета органоида парацеллюлярным путем или путем простой диффузии, апикальной стороны. Следовательно, невозможно нацеливаться на апикальные или базолатеральные транспортеры по отдельности, однако использование ингибиторов позволяет проиллюстрировать вклад определенных транспортеров. Таким образом, использование глюкозы в качестве субстрата в сочетании либо с флоридзином, либо с флоретином в органоидах человека, полученных из различных отделов тонкой кишки, привело к ожидаемому характеру притупленного захвата глюкозы, который был более выражен при использовании ингибитора pan-GLUT флоретина по сравнению с Ингибитор SGLT1 флоридзин ().Соответственно, транспорт фруктозы может быть уменьшен флоретином и, в меньшей степени, ингибитором GLUT5 рубузозидом (), а также глюкозой (дополнительная фигура 2C) в органоидах двенадцатиперстной кишки человека.

С целью улучшения экспериментальных протоколов был разработан второй подход к исследованию транспортных процессов с использованием неферментативно диссоциированных («расщепленных») органоидов вместо интактных органоидов (). В этом случае органоиды двенадцатиперстной кишки человека подвергались воздействию радиоактивно меченого дипептида глицил-саркозина (Gly-Sar), устойчивого к гидролизу модельного субстрата пептидного транспортера PEPT1.Транспорт пептидов через плазматическую мембрану происходит в котранспорте с протонами и позволяет транспортировать ди- и трипептиды против градиента субстрата [24]. Кроме того, PEPT1 также способствует всасыванию лекарств и пролекарств, включая некоторые ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), ингибиторы протеазы, противовирусные препараты и пептидомиметики, такие как аминоцефалоспорины (Ganapathy et al., 1995; Shu et al., 2001; Sugano et al. ., 2010; Коттра и др., 2013). Наряду с PEPT1-опосредованными потоками субстрата на апикальной мембране была описана еще не идентифицированная генетически система для базолатерального захвата пептидов с характеристиками, сходными с PEPT1 (Berthelsen et al. , 2013). Хотя анализы транспорта с радиоактивной меткой очень чувствительны, стоимость меченых субстратов является основным недостатком. Следовательно, желательно уменьшить количество субстратов, необходимых для экспериментов. При сравнении интактных органоидов и «разложившихся» органоидов, подвергшихся воздействию одинаковых концентраций радиоактивно меченного Gly-Sar, наблюдалось 4-кратное увеличение интенсивности сигнала. Конкурентное ингибирование поглощения Gly-Sar дипептидом глицил-глицином (Gly-Gly) продемонстрировало значительное снижение поглощения Gly-Sar в обоих подходах, при этом степень снижения не отличалась между интактными и «расщепленными» органоидами (1).Следовательно, использование «расщепленных» органоидов вместо интактных органоидов дает возможность не только снизить затраты, но и одновременно нацелиться на базолатеральные и апикальные транспортеры.

Как упоминалось ранее, переносчики пептидов также играют роль в поглощении лекарств, включая пептидомиметики. Пептидомиметики представляют собой соединения, имитирующие пептид или белок, обладающие способностью взаимодействовать с биологической мишенью, оказывая агонистическое или антагонистическое действие (Giannis, Kolter, 1993; Marshall, Ballante, 2017).Следовательно, они обладают большим потенциалом для открытия новых лекарств, обладая свойствами, подобными лекарствам (Rader et al., 2018a). Например, пептидомиметики были разработаны для лечения рака, например, для индукции апоптоза (Walensky et al., 2004), повышения чувствительности раковых клеток к химиотерапевтическим препаратам (Greer et al., 2011) или для целенаправленного воздействия на интегрины для вмешательства в ангиогенез и другие аспекты. биологии опухолей (Mas-Moruno et al., 2010; Nieberler et al., 2017). Основными целями разработки перорально доступных пептидов являются улучшение их кишечного транспорта и повышение их устойчивости к ферментативной деградации.Общие стратегии включают использование циклических пептидов, а также D-аминокислот вместо L-аминокислот и метилирование N для повышения метаболической стабильности (Rader et al. , 2018a). Например, циленгитид, циклический пентапептид с одной D-аминокислотой и одним метилированием N , полностью стабилен в организме человека и выводится с периодом полувыведения 4 часа без какого-либо метаболизма (Becker et al., 2015). Тем не менее, проникновение кишечника из просвета в кровоток остается серьезной проблемой. Структурные изменения влияют на кишечную и клеточную проницаемость, а изменение одного метильного положения уже может значительно повлиять на свойства проницаемости (Ovadia et al., 2011). Пероральная доступность (прохождение стенки желудочно-кишечного тракта для попадания в кровоток) может быть опосредована парацеллюлярными или трансцеллюлярными механизмами, включая активные переносчики (Rader et al., 2018a). На сегодняшний день невозможно предсказать влияние определенных химических модификаций на транспортную/пероральную биодоступность кандидатов в лекарства (Rader et al., 2018b), поэтому необходимы системы скрининга. Общие инструменты для оценки свойств проницаемости пептидных препаратов включают монослои Caco-2 и параллельную диффузионную камеру (камера Ussing), однако обе системы плохо коррелируют (Jezyk et al. , 1999; Бермехо и др., 2004 г.; Ovadia et al., 2011) и сталкиваются с серьезными недостатками. Клетки Caco-2, хотя известно, что они обладают фенотипом довольно тонкого кишечника (Yee, 1997), первоначально были получены из карциномы толстой кишки, и их фенотипические, а также функциональные характеристики сильно отличаются от нативных энтероцитов человека (Harwood et al., 2016) . Например, клетки Caco-2 имеют более плотные соединения по сравнению с тонким кишечником человека (Matsson et al., 2005), и было обнаружено, что они не подходят для оценки активного, опосредованного переносчиком всасывания пептидных лекарственных средств (Jezyk et al., 1999). Напротив, подходы с камерой Уссинга, в основном с использованием иссеченной ткани крысы, лучше отражают физиологию, но страдают от потенциальных видовых различий и большого количества животных, необходимых для скрининга. Следовательно, мы проверили применимость кишечных органоидов в качестве нового инструмента для оценки абсорбционных свойств пептидомиметиков. Были протестированы три различных циклических гексапептида (P1, P2, P3) (), которые изначально были разработаны с помощью поэтапного подхода к библиотеке: сначала библиотека из более чем 55 различных N -метилированных аланиновых пептидов общей структуры Ala-L-Ala ₅) были синтезированы и исследованы в анализе Caco-2 (Ovadia et al., 2011). Пептиды, идентифицированные как высокопроницаемые (включая P3 ), впоследствии функционализировали путем замены нейтральных остатков Ala на интегрин-связывающую трипептидную последовательность RGD. Среди них одно соединение ( P2 ) было идентифицировано с такой же высокой активностью и селективностью, что и циленгитид (субнаномолярное сродство к интегрину αvβ3, высокая селективность по отношению к другим интегринам) (Weinmuller et al., 2017). Однако P2 не обладал проницаемостью из-за зарядов циклических N -метилированных аланиновых пептидов.Чтобы преодолеть это ограничение, заряженные остатки были защищены липофильными защитными фрагментами (две гексилоксикарбонильные (Hoc) группы и превращение карбоксильной боковой цепи Asp в нейтрально заряженный метиловый эфир). Полученное соединение P1 показало как проницаемость в анализе Caco-2, так и биологическую активность после перорального введения мышам (Weinmuller et al., 2017). Чтобы проверить участие опосредованного транспортером активного пептида поглощения в свойствах проницаемости P1-P3 , мы оценили способность трех циклических гексапептидов конкурентно ингибировать поглощение меченого радиоактивным изотопом Gly-Sar в органоидах тонкого кишечника мышей, полученных из дикого типа. и Pept1-дефицитные мыши.В этом анализе мы идентифицировали P1 как потенциальный субстрат для активного транспорта, опосредованного Pept1, P2 , который активно транспортируется независимо от Pept1, и, напротив, P3 не проявлял признаков опосредованного пептидным транспортером поглощения в мышиных органоидах. (). Последующее тестирование P1 и P3 в органоидах двенадцатиперстной кишки человека показало, что оба пептида были способны значительно снижать поглощение радиоактивно меченого Gly-Sar, что указывает на то, что P1 и P3 являются субстратами для опосредованного переносчиком пептида поглощения у людей (). Эти данные подчеркивают пригодность кишечных органоидов для скрининга опосредованного транспортером поглощения кандидатов в лекарства, процесса, который, возможно, был недооценен в анализах Caco-2 из-за отсутствия физиологической экспрессии транспортера, но способствует пероральной доступности. Кроме того, процессы оттока, которые ограничивают абсорбцию лекарств, могут быть детально изучены в органоидных системах (Schumacher-Klinger et al., 2018). Одновременно эти данные указывают на потенциальные видоспецифичные транспортные фенотипы, как уже описано для PEPT1 (Kottra et al., 2013). Соответственно, мы также можем подтвердить транспорт пептидоподобного β-лактамного антибиотика цефадроксила, который ранее был описан как субстрат PEPT1 (Ganapathy et al., 1995; Zietek et al., 2015), в органоидах двенадцатиперстной кишки человека ().

В заключение, эти результаты подчеркивают превосходные свойства кишечных органоидов человека для изучения поглощения питательных веществ и лекарств. Поскольку органоиды сохраняют специфичные для местоположения свойства своего места происхождения, абсорбция может быть определена даже при разрешении, специфичном для области кишечника.

Визуализация процессов транспорта пептидов в кишечнике

Сообщалось, что конъюгированные с флуорофором дипептиды с высоким сродством к PEPT1 способны блокировать транспорт Gly-Sar, однако они не транспортируются (Abe et al., 1999). ; Коттра и др., 2013). Чтобы исключить подобные эффекты, можно применять либо специфические ингибиторы (например, Lys-z-NO2-Val, специфический ингибитор PEPT1), либо исследовать последующие эффекты транспортных процессов. Таким образом, мы расширили наш ранее установленный протокол для визуализации внутриклеточной передачи сигналов с помощью визуализации живых клеток кишечных органоидов мышей (Zietek et al., 2015), к человеческим органоидам и сигнальным событиям, индуцированным транспортом лекарств. Как упоминалось ранее, транспорт пептидов через плазматическую мембрану происходит в котранспорте с протонами, что приводит к закислению цитозоля энтероцитов (Chen et al., 2010). Следовательно, внутриклеточные изменения немедленно отражают транспортную активность и предоставляют прямые доказательства потоков субстрата. Падение pH можно визуализировать с помощью визуализации живых клеток с использованием флуоресцентных зондов (Chen et al., 2010; Zietek et al., 2015). С использованием pH-индикатора BCECF-AM было продемонстрировано внутриклеточное подкисление органоидов двенадцатиперстной кишки человека при воздействии Gly-Sar, Gly-Gly, а также цефадроксила и карбонилцианида м-хлорфенилгидразина (CCCP, ионофор, используемый в качестве положительного контроля). ().Стимуляция органоидов с помощью CCCP после введения Gly-Sar, Gly-Gly и цефадроксила вызвала дополнительное снижение внутриклеточного pH, что указывает на физиологический диапазон наблюдаемых ответов (дополнительная фигура 3A). Как и ожидалось, ни глюкоза, ни фруктоза (используемые в качестве отрицательного контроля) не приводили к внутриклеточному закислению энтероцитов (дополнительная фигура 3B). Поскольку визуализация потоков кальция в живых клетках обычно применяется в фармакологических скринингах для обнаружения активации рецепторов предполагаемым лигандом/лекарством, а также активности многих транспортеров (например,g. , PEPT1) (Wenzel et al., 2002) и события внутриклеточной транслокации (например, GLUT2) (Kellett et al., 2008) регулируются с помощью внутриклеточного кальция, мы подтвердили применимость кальций-индикатора Fura-2-AM. в органоидах человека. Согласно литературным данным, устойчивые сигналы были получены при АТФ-опосредованном увеличении внутриклеточного кальция (14). Для обоих красителей, BCECF-AM и Fura-2-AM, наблюдалась превосходная эффективность загрузки красителя (дополнительная фигура 3C).

Визуализация процессов транспорта пептидов в кишечнике.Внутриклеточное закисление, визуализируемое BCECF-AM, индуцированное транспортом субстратов пептидных переносчиков (A) Gly-Sar и (B) Gly-Gly, (C) антибиотиком цефадроксилом и (D) протонофором CCCP. (E) Ответы кальция на стимуляцию АТФ, визуализированные с помощью Fura-2. Внутриклеточное закисление, вызванное антибиотиком цефадроксилом. (F) Схематическое изображение исследованных переносчиков и используемых ингибиторов. (G) Курс внутриклеточного закисления, вызванный воздействием Gly-Sar в течение длительного периода времени (слева) с и (в центре) без NHE-ингибитора амилорида; справа: наложение обеих кривых, дающее относительные отношения BCECF. (H) Подход аналогичен (G) с использованием ингибитора NHE3 S1611. (A–E) органоиды двенадцатиперстной кишки человека, (G,H) органоиды тонкой кишки мыши. Для анализа данных были выбраны целые органоиды, и фоновая коррекция не применялась. Были проведены анализы нескольких органоидов, полученных из независимых культур, и показаны репрезентативные измерения.

Для непрерывного захвата пептидов IEC необходимо поддерживать трансмембранные ионные градиенты и, кроме того, следует избегать усиленного или длительного закисления клетки протонным симпортом переносчиков пептидов.Следовательно, протоны экспортируются в обмен на Na ⁺ с помощью натрий-протонных обменников (NHE) (дополнительная фигура 1A). В энтероцитах экспрессируются несколько типов NHEs, и, в частности, было показано, что NHE3 необходим для правильного PEPT1-опосредованного транспорта (Chen et al., 2010). Важно отметить, что на функцию NHE нацелены как клинически значимые препараты, так и бактериальные токсины. Различная роль NHE3 в абсорбции Na ⁺ при нормальном пищеварении, а также при острых и хронических диарейных заболеваниях была исследована на энтероидах человека Foulke-Abel et al.(2016), подчеркивая возможность идентифицировать мишени для наркотиков в этой системе. Чтобы проиллюстрировать функцию NHE в целом и NHE3 в частности в контексте активного транспорта пептидов в органоидах, мы использовали два разных ингибитора: амилорид, одобренный FDA ингибитор NHE, и S1611, который преимущественно действует на NHE3 (Wiemann et al. ., 1999). Как и ожидалось, оба ингибитора препятствовали восстановлению внутриклеточного pH до исходного уровня, как это наблюдалось в необработанных мышиных органоидах после воздействия Gly-Sar (слева). В соответствии со своим специфическим ингибирующим спектром амилорид приводил к непрерывному притоку протонов в течение наблюдаемого промежутка времени (), в то время как обработка S1611 приводила к стабильному внутриклеточному уровню рН ниже исходного уровня (). Чтобы расшифровать биологию и функциональные характеристики кишечных транспортеров, очень важно не только количественно определить транспорт субстратов, но также принять во внимание внутриклеточные нижестоящие эффекты и передачу сигналов, как представлено выше. Эти данные подчеркивают возможности измерений с высоким разрешением в кишечных органоидах.

Анализ метаболитов в кишечных органоидах

Метаболизм в IEC привлекает все большее внимание не только из-за экспрессии ключевых ферментов, метаболизирующих лекарственные средства, включая цитохром P450 3A4 (CYP3A4), в эпителиальных клетках тонкого кишечника, которые подвержены воздействию диетических препаратов. взаимодействия (Lown et al., 1997). ИЭК и метаболизм всего организма тесно взаимосвязаны посредством продукции инкретиновых гормонов (Zietek and Rath, 2016) и таких факторов, как Fgf15 (Kliewer and Mangelsdorf, 2015), энтероэндокринными клетками и энтероцитами соответственно, и наоборот, ИЭК являются мишенями отдаленных тканей. метаболические сигналы, такие как передача сигналов инсулина и лептина (Yilmaz et al., 2012; Ле Дрин и Сеген, 2014). В желудочно-кишечном тракте углеводы, пептиды и липиды расщепляются и всасываются энтероцитами. Впоследствии они служат субстратами для генерации клеточной энергии или для взаимопревращений и распределения по всему организму посредством переноса в кровоток. Следовательно, метаболизм IEC также сильно влияет на доступность и качество питательных веществ, составляя начальную контрольную точку между диетой и хозяином. В этом контексте кишечная микробиота играет дополнительную ключевую роль как источник бактериальных метаболитов, таких как короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), включая бутират.Метаболизм IEC и воздействие определенных питательных веществ, кроме того, связаны с заболеваниями, например, диеты с высоким содержанием жиров, как было показано, усиливают онкогенность кишечных клеток-предшественников (Beyaz et al., 2016), а SCFAs и лактат способствуют процессам заживления кишечника (Lee et al. , 2018; Парада Венегас и др., 2019). Несмотря на то, что общие метаболические функции энтероцитов понятны, остается много открытых вопросов, в том числе вопрос о том, может ли тонкая кишка выступать в качестве места глюконеогенеза, который, по-видимому, зависит от вида (Sinha et al., 2017; Поттс и др., 2018 г.; Varga et al., 2019), или как взаимодействуют абсорбция и метаболизм углеводов и липидов. Метаболомические подходы являются ключевыми технологиями, позволяющими решать такие вопросы, позволяя проводить крупномасштабный и высокопроизводительный анализ метаболических событий.

Чтобы проверить возможность измерения метаболизма в кишечных органоидах, мы применили различные экспериментальные схемы для воспроизведения/подтверждения эффектов, описанных в литературе. Во-первых, мы определили влияние инсулина на уровни аминокислот (АК) и ацилкарнитина в органоидах тонкого кишечника.Кишечные органоиды мышей лишали инсулинсодержащей добавки среды N2 (тем не менее, добавка B27 содержит остаточный инсулин в концентрации а/а) в течение ночи, стимулировали 1 мкМ инсулина, а АА и ацилкарнитины измеряли через 0, 30, 60 и 120 мин (). Все протеиногенные аминокислоты могут быть обнаружены в органоидах тонкого кишечника в диапазонах концентраций, указанных в . Известно, что инсулин способствует анаболизму, влияя как на процессы синтеза белка, так и на процессы протеолиза. Энтероциты реагируют на сигналы инсулина и развивают резистентность к инсулину в условиях воспаления, связанного с ожирением (Monteiro-Sepulveda et al., 2015), и, в частности, было продемонстрировано, что лишение инсулина снижает биосинтез белка в тонкой кишке, эффект, который можно устранить с помощью лечения инсулином (Charlton et al., 2000). В свою очередь, концентрации валина и аланина быстро реагировали на стимуляцию инсулином, демонстрируя максимальное снижение через 30 минут после добавления инсулина (1), что согласуется с большинством других АК (данные не показаны), что указывает на сдвиг в обмене белка в сторону повышенного чистого включения АК в белки. Параллельно снижалось содержание тау-метилгистидина, маркерного соединения для протеолиза, и пропионилкарнитина (С3), типичного промежуточного продукта в расщеплении валина, изолейцина, метионина и треонина, при этом самые низкие уровни наблюдались через 60 минут после стимуляции инсулином (2), что также подтверждает ингибирующее действие Влияние инсулина на протеолиз органоидов кишечника.

Анализ метаболитов в кишечных органоидах. (A) Схематическое изображение экспериментальной установки, из которой были получены образцы для анализа, показанного на панели (B, C) . (B) Диапазон концентраций аминокислот (АК), обнаруженных в органоидах. (C) Концентрация валина и аланина в разные моменты времени после стимуляции инсулином. (D) Концентрация тау-метилгистидина, маркерного соединения для протеолиза, и пропионилкарнитина (С3), типичного промежуточного продукта распада валина, в разные моменты времени после стимуляции инсулином. (E) Схематическое изображение экспериментальной установки, из которой были получены образцы для анализа, показанного на панели (F) . (F) Концентрация видов ацилкарнитина Ацетилкарнитин (C2), бутирилкарнитин (C4) и пальмитоилкарнитин (C16) в различные моменты времени после добавления бутирата. (G) Предлагаемый механизм воздействия бутирата на бета-окисление. (H) Схематическое изображение экспериментальной установки, из которой были получены образцы для анализа, показанного на панели (I) . (I) Появление меченных дейтерием ацилкарнитинов в разные моменты времени после добавления меченного дейтерием d31-пальмитата. (J) Схематическое изображение карнитинацилтрансфераз, участвующих в образовании обнаруженных видов ацилкарнитина. (B,C,F,I) Репрезентативные результаты трех независимых культур органоидов. ASCL, длинноцепочечная ацил-КоА-синтетаза; CPT, карнитинпальмитоилтрансфераза; CAT, карнитинацетилтрансфераза; CACT, карнитин-ацилкарнитинтранслоказа.

Далее мы описываем влияние бутирата на профили ацилкарнитина в органоидах толстого кишечника мышей. В этом подходе добавляли 1 мМ бутирата и измеряли сдвиги ацилкарнитинов через 0, 5, 10, 30 и 60 минут после этого (). Было показано, что бутират оказывает широкое влияние на метаболизм колоноцитов, включая утилизацию глюкозы (Donohoe et al. , 2012) и окисление жиров (den Besten et al., 2015), в свою очередь регулируя ход клеточного цикла и пролиферацию (Donohoe et al., 2012). . Согласно литературным данным, наблюдалось явное влияние бутирата на насыщенные ацилкарнитины, включающие ацилкарнитины с короткой, средней и длинной цепью, при этом ацетилкарнитин, бутирилкарнитин и пальмитоилкарнитин увеличивались до максимальных концентраций через 60 минут после добавления бутирата ().Предложенный механизм, объясняющий действие бутирата, включает переносчик бутирата SLC5A8 и рецептор бутирата GPR109A, экспрессируемые колоноцитами (Cresci et al., 2010), опосредуя активацию передачи сигналов PPARγ, что, в свою очередь, увеличивает экспрессию карнитин-пальмитоил-КоА-трансферазы (CPT1) и карнитин-ацилкарнитинтранслоказа (SLC25A20/CACT) для усиления митохондриального бета-окисления (Vanhoutvin et al., 2009; den Besten et al., 2015; ).

И последнее, но не менее важное: мы следили за распадом d31-меченой пальмитиновой кислоты, в которой все 31 атом водорода заменены атомами дейтерия, в органоидах тонкого кишечника. Мечение стабильным изотопом позволяет проследить судьбу меченой жирной кислоты в энтероците: она либо подвергается укорочению цепи во время бета-окисления и превращению в соответствующие виды ацилкарнитина для выработки энергии, либо реэтерифицируется и включается в хиломикроны для системного снабжения. Важно отметить, что определение пищевого жира посредством окисления жирных кислот в энтероцитах участвует в контроле приема пищи (Langhans et al., 2011), а модуляция метаболизма энтероцитов может влиять на гомеостаз глюкозы в организме и развитие вызванного диетой ожирения (Schober et al. др., 2013; Рамачандран и др., 2018). Перед добавлением пальмитиновой кислоты, меченной d31, органоиды тонкого кишечника мышей инкубировали с CCM, приготовленным с использованием DMEM/F12 с низким содержанием глюкозы, в течение 24 часов. DMEM/F12 с низким содержанием глюкозы содержит 1 г/л глюкозы, что соответствует 5,5 мМ глюкозы, что находится в физиологических пределах. Появление меченных дейтерием ацилкарнитинов определяли через 0, 10, 30 и 60 мин после добавления d31-пальмитиновой кислоты (1). Указав на бета-окисление, мы могли обнаружить укороченные цепи, меченные дейтерием виды ацилкарнитина (1).Известно, что превращение длинноцепочечных жирных кислот в их ацилкарнитиновые разновидности опосредуется карнитинпальмитоилтрансферазами 1 и 2 (CPT1 и CPT2), в то время как ацилкарнитиновые разновидности с короткой цепью образуются карнитинацетилтрансферазой (CAT) (). Карнитиноктаноилтрансфераза (COT), расположенная в пероксисомах, отвечает за превращение жирных кислот со средней длиной цепи (Violante et al., 2013). Напротив, CPT1 расположен на внешней митохондриальной мембране и, таким образом, может преобразовывать добавленную d31-пальмитиновую кислоту непосредственно в d31-пальмитоилкарнитин (Bonnefont et al., 2004). На линии сразу после добавления d31-пальмитиновой кислоты ( t = 0) был обнаружен пик d31-пальмитоилкарнитина (d31-C16:0), который увеличивался в последующие моменты времени (). Более короткие промежуточные жирные кислоты образуются в митохондриях, а соответствующие им виды ацилкарнитина генерируются CPT2 и CAT, расположенными во внутренней митохондриальной мембране. В соответствии с последовательным удалением 2-углеродных звеньев во время бета-окисления, d27-миристоилкарнитин (d27-C14:0) и, в меньшей степени, d23-додеканоилкарнитин (d23-C12:0) можно было увидеть уже через 10 минут инкубации. тогда как d19-деканоил-, d15-октаноил- и d11-гексаноилкарнитин появлялись через 30 мин после добавления d31-пальмитиновой кислоты.Все эти промежуточные продукты показали возрастающие пики для t = 60 (). Следует отметить, что более высокие пики d11-C6 по сравнению с d19-C10 и d15-C8 через 30 и 60 мин могут быть объяснены более высоким предпочтением CAT для субстратов короткоцепочечных жирных кислот (от C2 до C6).

Таким образом, кишечные органоиды представляют собой превосходную модельную систему, близкую к физиологии, для изучения клеточного метаболизма, а применяемые метаболические данные можно легко адаптировать к трехмерной культуре. Человеческие органоиды, представляющие собой наиболее подходящую модель, превосходят органоиды животного (грызунов) и (раковые) клеточные линии, особенно в контексте метаболизма и болезней, поскольку метаболические свойства у разных видов различаются, а изменения клеточного метаболизма являются частью многие патологии. Таким образом, органоиды человека обладают большим потенциалом для ответа на остающиеся вопросы о кишечном метаболизме и определения мишеней для лекарств для улучшения общего метаболического здоровья.

Заключение

В совокупности наши результаты показывают, что кишечные органоиды, культивированные в 3D, погруженные в гель-купол, богатый ламинином, являются наиболее простым и, вероятно, наименее затратным и трудоемким экстенсивным протоколом культивирования, подходящим для широкого диапазона измерений в области кишечного транспорта и метаболических исследований.Помимо этих приложений, в этой установке возможны многие другие показания, например, оценка активности протеасом (дополнительная фигура 2D), которая представляет интерес в контексте ингибиторов протеасом, важного класса лекарств при лечении различных видов рака ( Фрикер, 2020).

Простые усовершенствования и «уловки», такие как изменение состава среды для стимулирования дифференциации или «разрушения» органоидов перед исследованием поглощения, помогают еще больше улучшить результаты и снизить затраты. Внедрение других протоколов культивирования, таких как органоиды с обратной полярностью (в которых апикальная сторона обращена наружу) (Co et al., 2019) или органоиды, засеянные в двумерном слое в трансвелловых планшетах (VanDussen et al., 2015; Wang et al., 2019). ) — это дополнительные дороги. Парацеллюлярный транспорт флуоресцеина, трансцеллюлярный транспорт пропранолола и базолатеральный отток родамина123, субстрата p-гликопротеина (MDR1), были измерены в модели, в которой клетки, происходящие из органоидов человека, высевают в виде двумерного монослоя на каркас тонкой кишки свиньи. (Швайнлин и др., 2016), дополняя наш подход без животных, ориентированный на активное, опосредованное транспортером поглощение субстрата.

Область применения органоидов по-прежнему быстро растет, и наблюдается тенденция к созданию более сложных и изощренных систем моделирования на основе органоидов. Например, совместное культивирование с бактериальными и вирусными патогенами и иммунными клетками (Yin et al. , 2015; Dutta and Clevers, 2017), а также подходы к воспроизведению сложной тканевой среды, включающей непрерывно протекающие жидкостные системы, или к отражению множественных взаимодействия органов (органоиды на чипе) были разработаны (Almeqdadi et al., 2019). Эти системы обеспечивают микросреду для изучения влияния оксигенации, механического стресса и связи тканей с помощью растворимых факторов и будут способствовать дальнейшему развитию исследований кишечника. Тем не менее, на сегодняшний день они остаются очень дорогими инструментами в узкоспециализированных лабораториях, не пригодными для широкого применения (Almeqdadi et al., 2019). Напротив, протоколы и методы культуры кишечных органоидов, представленные здесь, представляют собой моделей in vitro , которые уже сейчас позволяют частично заменять и сокращать количество животных, необходимых для исследований и испытаний.

Хотя разработанные нами методологии применимы к органоидам мыши и человека, при решении проблем, связанных с человеком, следует сосредоточить внимание на технологии человеческих органоидов. Показатели успеха разработки лекарств особенно низки при широко распространенных заболеваниях, таких как диабет (Ali et al., 2018) или рак (Mak et al., 2014). Только от 5 до 10 процентов лекарств, безопасность и эффективность которых доказаны в доклинических исследованиях на животных, попадают на рынок (Arrowsmith, 2012; Thomas et al., 2016). Видоспецифичные различия и, следовательно, плохая переносимость моделей животных на людей являются основной причиной такого высокого уровня неудач (Arrowsmith and Miller, 2013; Cook et al., 2014; Маллард, 2016).

В связи с этим мы предлагаем инновационные подходы к физиологически значимым испытаниям in vitro в области исследований кишечника и метаболомики. В частности, использование человеческих органоидов в этом контексте является очень ценным инструментом для открытия и тестирования лекарств, а также для моделирования заболеваний, связанных с человеком.

Трехмерные органоиды, полученные из тонкой кишки: новый инструмент для исследования транспорта лекарств

https://doi.

org/10.1016/j.apsb.2020.12.002Получить права и содержание

Abstract

Тонкая кишка Модели in vitro играют решающую роль в исследованиях транспорта лекарств. Хотя обычные 2D-модели клеточных культур, такие как монослой Caco-2, обладают многими преимуществами, их следует интерпретировать с осторожностью, поскольку они имеют относительно плохие физиологически воспроизводимые фенотипы и функции. С развитием технологии 3D-культивирования плюрипотентные стволовые клетки (PSC) и взрослые соматические стволовые клетки (ASC) демонстрируют замечательные характеристики самоорганизации, что приводит к развитию кишечных органоидов.Основываясь на предыдущих исследованиях, в этой статье рассматривается применение кишечных 3D-органоидов в транспорте лекарств, опосредованном P-гликопротеином (P-gp), белком устойчивости к раку молочной железы (BCRP) и белком множественной лекарственной устойчивости 2 (MRP2). Также обсуждаются преимущества и ограничения этой модели. Несмотря на то, что существует еще много проблем, трехмерная модель кишечных органоидов может стать отличным инструментом для исследования транспорта лекарств.

Ключевые слова

3D Ключевые слова

3D Органоидные

Транспортировка препарата

CACO-2 Monolayer

P-GlycoProtein

Сокращения

ASCS

Взрослых соматических стволовых клеток

BCRP

Устойчивость к раку молочной железы

BMP

Морфогенетический белок BMP

CDF

5(6)-карбокси-2′,7′-дихлорфлуоресцеин

cMOAT

канальцевый мультиспецифический переносчик органических анионов

DDI

лекарственные взаимодействия

EGF

эпидермальный фактор роста

FGF

индуцируемый фибробластами фактор роста pl4

0 iPuri клетки

Lgr5 ⁺

лейцин-богатый повтор-содержащий G-белок-связанный рецептор 5 положительный

MCT

белок-транспортер монокарбоксилата

MRP2

белок 2 множественной лекарственной устойчивости OCT

переносчик органических катионов

OCTN

карнитин/органи C Cat Cation Transporter

P _APP

Коэффициент кажущегося проницаемости

PEPT

Пептид Транспортер Белок

PMAT

Плазменная мембрана Monoamine Transporter

PSCS

Pluripotent стволовые клетки

TEER

Трансевителиальное электрическое сопротивление

TMDS

Трансмирембранные домены

Ссылки на статьи

Органоиды: новый взгляд на болезни, разработки и открытия

Ученые нашли способы культивирования органоспецифической ткани из стволовых клеток, которые могут изменить подход к изучению и лечению заболеваний.

Хавьер Барбузано

Представьте себе возможность создания индивидуализированных сложных коллекций клеток, которые имеют сходство с собственными тканями пациента.Эта технология — способность выращивать «органоиды» — становится реальностью и каждый день находит новые применения, отчасти благодаря работе ученых из Гарвардского института стволовых клеток.

Органоиды — это крошечные самоорганизующиеся трехмерные культуры тканей, полученные из стволовых клеток. Такие культуры могут быть созданы для воспроизведения большей части сложного органа или для экспрессии отдельных его аспектов, таких как производство только определенных типов клеток.

Органоиды вырастают из стволовых клеток — клеток, которые могут неограниченно делиться и производить различные типы клеток как часть своего потомства.Ученые научились создавать подходящую среду для стволовых клеток, чтобы они могли следовать своим собственным генетическим инструкциям для самоорганизации, образуя крошечные структуры, напоминающие миниатюрные органы, состоящие из многих типов клеток. Размер органоидов может варьироваться от менее ширины волоса до пяти миллиметров.

Потенциально существует столько типов органоидов, сколько различных тканей и органов в организме. На сегодняшний день исследователи смогли создать органоиды, напоминающие мозг, почки, легкие, кишечник, желудок и печень, и многие другие находятся в процессе разработки.

Этот способ культивирования тканей даст ученым подробное представление о том, как формируются и растут органы, даст им новое представление о развитии человека и болезнях, а также даст им возможность увидеть, как лекарства взаимодействуют с этими «мини-органами», потенциально революционизируя области открытия лекарств и открытия новых подходов к персонализированной медицине.

Некоторые из этих применений освещены ниже в работе четырех лабораторий ИСКЧ.

Понимание себя и моделирование болезни

Большая часть того, что мы знаем об эмбриональном развитии, была получена путем экстраполяции на человеческую биологию того, что наблюдается у мышей и других моделей животных.Теперь, благодаря органоидам, у исследователей есть возможность культивировать крошечные версии каждой ткани, используя человеческие клетки.

В случае с человеческим мозгом эта технология открывает окно для наблюдения за некоторыми из самых неуловимых аспектов нашей собственной биологии. Это становится особенно важным при попытке изучить сложные, присущие человеку характеристики или болезни. «Некоторые из наиболее известных нейропсихиатрических заболеваний или заболеваний нервной системы нашего времени, такие как шизофрения или расстройство аутистического спектра, являются уникальными человеческими заболеваниями, которые затрагивают весь человеческий геном», — объясняет исследователь ИСКЧ Паола Арлотта, доктор философии.

Лаборатория Арлотты разработала протоколы, которые позволяют органоидам расти в течение длительных периодов времени, достигая большей сложности и зрелости, чем раньше. Эти органоиды содержат тысячи клеток и несколько типов клеток мозга, которые сложным образом взаимодействуют друг с другом, что делает их отличными моделями для изучения того, как нейропсихиатрические патологии или патологии развития нервной системы влияют на то, как клетки мозга общаются друг с другом.

Исследователи уже смогли использовать органоиды, полученные от пациентов с аутизмом, для выявления аномалий в регуляции генов, участвующих в пролиферации клеток.Другие исследователи использовали органоиды, чтобы наблюдать, как вирус Зика ассоциируется с микроцефалией во время раннего развития эмбриона, когда он препятствует нормальному развитию мозга, вызывая преждевременную дифференцировку клеток, продуцирующих нейроны. А другие смотрят на то, как эти органоиды, как «нормальные», так и «больные», реагируют на определенные раздражители.

Органоиды мозга также помогут понять, как мозг формируется на ранних стадиях развития, что изучается уже более века и до сих пор ставит ученых в тупик.«Настоящая цель прямо сейчас — использовать органоиды в качестве моделей болезней, но я предсказываю, что по пути мы многое узнаем о том, как формируется мозг», — сказал Арлотта.

Изучение болезней стволовых клеток и персонализированная медицина

Стволовые клетки имеют большие перспективы в качестве терапевтических инструментов благодаря их неограниченной способности делиться и регенерировать ткани. Но исследователи также понимают, что многие заболевания могут быть вызваны аномалиями в самих стволовых клетках или в том, как другие клетки взаимодействуют с ними.

Такие исследователи, как Карла Ким, доктор философии, используют органоиды, чтобы определить роль стволовых клеток в регенерации, поддержании и функционировании тканей, а также понять, как эти клетки взаимодействуют друг с другом.

Ким и ее группа были первыми учеными, которые вырастили органоиды легких, имитирующие две отдельные части легкого: дыхательные пути и альвеолярные мешочки, где происходит газообмен. Они сделали это с помощью специальной установки для культивирования, которая позволяла клеткам контактировать как с воздухом, так и с жидкостью, имитируя среду легких.Их культура также включала вспомогательные клетки, полученные из кровеносных сосудов, для стимуляции роста стволовых клеток.

«Мы хотим знать, как стволовая клетка узнает, какой тип специализированных клеток она должна производить», — сказал Ким. Органоиды помогают ответить на этот вопрос. «Мы спрашиваем, какие факторы и соединения должны присутствовать, чтобы сообщить стволовым клеткам, что им нужно для роста».

Ким использует аналогичный подход для изучения обратной стороны этого вопроса: что происходит при заболеваниях, когда стволовые клетки либо не справляются со своей задачей, либо создают дефектные клетки?

«Многие заболевания легких кажутся нам неисправностью стволовых клеток, когда они не в состоянии восстанавливать повреждения», — сказал Ким.«Долгое время считалось, что такие заболевания, как эмфизема, могут быть вызваны дефектами стволовых клеток, но проверить эту идею не представлялось возможным. Теперь мы можем создавать органоиды из больных клеток и проводить эксперименты, чтобы выяснить, являются ли стволовые клетки или разговаривающие с ними вспомогательные клетки причиной заболевания легких. Если мы сможем понять, что идет не так на уровне стволовых клеток, может появиться совершенно новый тип клеток, который может стать мишенью для лекарств».

Органоиды также можно использовать для непосредственного скрининга лекарств, которые могут способствовать образованию специализированного типа клеток. Это может помочь найти методы лечения таких заболеваний, как кистозный фиброз, при котором реснитчатые клетки, которые обычно удаляют слизь из легких, не работают должным образом.

«Мы можем создавать органоиды с реснитчатыми клетками, полученными от пациентов, а затем тестировать их на наличие лекарств, которые могли бы заставить эти реснитчатые клетки работать лучше», — сказал Ким. «Мы можем сделать органоиды из ИПСК, полученных из крови пациента, и протестировать эти специфические для пациента клетки легкого, даже не прибегая к биопсии. Возможности органоидов безграничны.Это очень захватывающее время для изучения легких».

Органоиды как терапевтические инструменты

Несколько команд в Гарварде и других местах пытаются придумать способы трансформации и трансплантации клеток или даже тканей, которые могли бы служить лекарством или средством лечения определенных заболеваний.

Это касается ученого ИСКЧ Дэвида Бро, доктора медицины, доктора философии, который вместе с другим исследователем ИСКЧ, Цяо Чжоу, доктором философии, добился новаторских достижений в преобразовании кишечных клеток в бета-клетки, продуцирующие инсулин.Их подход может привести к лечению диабета, большой проблемы общественного здравоохранения.

Диабет — это метаболическое заболевание, связанное с инсулином, гормоном, вырабатываемым поджелудочной железой, который позволяет нашим клеткам поглощать глюкозу из кровотока. Существует два типа диабета: тип 1, при котором иммунная система атакует бета-клетки, вырабатывающие инсулин; и тип 2, при котором клетки становятся устойчивыми к инсулину, поэтому его запаса в организме недостаточно для контроля уровня глюкозы в крови.

Бро и Чжоу разработали метод трансформации эпителиальных клеток кишечника в бета-клетки, продуцирующие инсулин, и протестировали свой метод на кишечных органоидах.Эта трансформация возможна, потому что эти клетки происходят из одного и того же региона во время развития и имеют много общих характеристик.

Они также смогли показать, что могут имплантировать матрицу, загруженную этими модифицированными клетками, продуцирующими инсулин, диабетической мыши, которая затем успешно регулирует уровень сахара в крови.

Breault делает еще один шаг вперед и намекает на возможность производства органоидов из иПС-клеток, полученных от пациентов, которые могут быть преобразованы в бета-подобные клетки, продуцирующие инсулин.

«Возможность создавать клетки-предшественники, специфичные для пациента, которые могут быть преобразованы в бета-клетки за один или два этапа, может представлять собой значительный прогресс в лечении диабета», — сказал Бро.

Революция в открытии лекарств

Не на каждый исследовательский вопрос нужно отвечать, используя сложные тканеподобные культуры, состоящие из разнообразных клеток.

Некоторым ученым нужны только определенные типы клеток, похожие друг на друга.Одним из примеров является процесс открытия лекарств, когда необходимо протестировать множество веществ на клетках, чтобы увидеть, как они работают.

На сегодняшний день для проведения таких тестов фармацевтическая промышленность полагалась на модели животных и линии клеток человека, которые мало похожи на нормальные или больные ткани. По словам члена Исполнительного комитета ИСКЧ Ли Рубина, доктора философии, это может быть одной из причин высокого уровня неудач клинических испытаний, что усугубляет высокую стоимость открытия нового лекарства — в среднем 2 миллиарда долларов за каждое новое лекарство, поступившее в аптеку.

Рубин считает, что использование человеческих клеток, а не животных моделей, может ускорить и повысить эффективность процесса открытия и разработки лекарств.

Лаборатория Рубина работает над сфероидами мозга, плотно населенными шарами нейронов, которые постоянно производят один или несколько типов клеток в больших количествах. Этот метод дает больше клеток и лучшего качества, чем традиционные плоские культуры на чашке. Это похоже на массовое производство, экономичный подход к культуре клеток.

Помимо развития из эмбриональных клеток, сфероиды также могут быть получены из собственных клеток пациента и помещены в биобанк клеток, специфичных для пациента. Сочетая такие биобанки с клиническими и геномными данными, можно разработать и протестировать индивидуальные планы лечения для каждого пациента. Этот подход также может позволить идентифицировать группы пациентов, которые лучше реагируют на одни виды лечения, чем на другие.

Возможность производить неограниченное количество тканей от каждого пациента также будет чрезвычайно полезно для изучения и лечения редких заболеваний, когда количество пациентов, на которых можно проводить исследования и тестировать лечение, ограничено.Это позволит исследователям проводить свои исследования в более широком масштабе, ускоряя прогресс в лечении этих часто недостаточно изученных заболеваний.

Стандартизированное масштабируемое производство органоидов поджелудочной железы человека в соответствии с GMP | Исследования и терапия стволовых клеток

Ткань поджелудочной железы взрослого человека

Здоровая поджелудочная железа человека была получена из Исследовательского института диабета, IRCCS Ospedale Ospedale San Raffaele, Милан, Италия, от доноров нескольких органов (Дополнительный файл 1: Таблица S1).Использование человеческих образцов было одобрено Институциональным наблюдательным советом. Островки человека выделяли, как описано ранее [25], в Центре обработки островков поджелудочной железы, аккредитованном Национальном центре трансплантологии (IT000679, https://webgate. ec.europa.eu/eucoding/reports/te/index.xhtml). Критериями приемлемости для доноров поджелудочной железы были возраст 18–65 лет, работающее сердце и констатация смерти головного мозга, известная причина смерти, отрицательный результат на ВИЧ, ВГВ, ВГС, анти-HBc, VDRL-TPHA, отсутствие факторов риска, системных инфекций и диабет, уровень амилазы в три раза превышает нормальный диапазон.Ткани поддерживали в растворе 0,9% NaCl (Fresenius Kabi, MAH 035725035, Бад-Хомбург-фор-дер-Хёэ, Германия) с 10% (об./об.) раствором сывороточного альбумина человека (Kedrion, MAH 022515163, Барга, Италия) и транспортировали из коллекции. к месту манипуляций с hPO в специальном грузоотправителе (B Medical System, MT 4B, Люксембург) при 21 ± 4 °C с устройством для определения температуры (регистратор данных; Testo SE & Co. KGaA, 174 T, Settimo M.se, Италия) в соответствии с инструкциями производителя. Истощенная островками ткань, оставшаяся после выделения островков (исходный материал), была обработана для выделения hPO в течение 36 часов после первоначальной обработки. Этапы контроля качества (КК), включая загрузку журнала данных для оценки поддержания температуры во время транспортировки и проверки транспортных документов, были выполнены вскоре после доставки.

Выделение и культивирование органоидов поджелудочной железы

Ткань поджелудочной железы взрослого человека с обедненными островками была перенесена под ламинарный колпак. Образец объемом 1 мл был взят для тестирования на стерильность с помощью валидированного метода bact-Alert GMP (bioMérieux, Марси-л’Этуаль, Франция) [26] и 1 мл был диссоциирован в суспензию отдельных клеток, как описано ниже, для тестирования. жизнеспособность сырья методом проточной цитометрии.Затем сырье расщепляли в Liberase MTF C/T (0,125 мг/мл, Roche, кат. номер 5339880001, Базель, Швейцария), нейтральной протеазе (0,125 мг/мл, Serva кат. № 30303.01, Гейдельберг, Германия) и ДНКазе I. (0,1 мг/мл, Roche, ref. 3724751103) в полной среде человека [27] (см. ниже) при 37 °C в течение ≤ 2 ч или механически диссоциировать с помощью диссоциатора GentleMACS™ (Miltenyi Biotec, Teterow, Germany) с программным обеспечением программа m_spleen04 (4×). Целые или обогащенные протоками фрагменты ткани поджелудочной железы были помещены в экстракт базальной мембраны типа 2 (BME2; Trevigen, ref.3533-005-02, Gaithersburg, MD) и культивировали в полной человеческой [среде AdDMEM/F12 (Life Technologies ref. 12634-010, Monza, Italy) с добавлением HEPES (1×, Life Technologies ref. 15630-056, Monza, Италия), Glutamax (1×, Life Technologies, реф. 35050-038, Монца, Италия), B27 минус витамин A (1×, Life Technologies, реф. 12587-010, Монца, Италия), добавка N2 (1×, Life Technologies № 17502-048, Монца, Италия) N-ацетил-L-цистеин (1 мМ, Sigma-Aldrich, № A9165, Милан, Италия), рекомбинантный белок R-спондин-1 (RSPO1) (1 мкг/мл, Peprotech исх.120-38. Лондон, Великобритания) или кондиционированная среда RSPO1, рекомбинантный белок Noggin (0,1 мкг/мл, Peprotech ref. 120-10C, Лондон, Великобритания), эпидермальный фактор роста (EGF, 50 нг/мл, Peprotech ref. AF-100-15, Лондон, Великобритания), гастрин (10 нМ, Sigma-Aldrich ref. G9145, Милан, Италия), фактор роста фибробластов 10 (FGF10, 100 нг/мл, Prepotech ref. 100-26, Лондон, Великобритания), никотинамид (10 мМ , Sigma-Aldrich ref. N0636, Милан, Италия), форсколин (10 мкМ, Tocris Bioscience ref. 1099, Бристоль, Великобритания), PGE-2 (3 мкМ, Tocris Bioscience ref.2296, Бристоль, Великобритания) и A83-01 (0,5 мкМ, Tocris Bioscience ref. 2939, Бристоль, Великобритания)]. Там, где это возможно, все компоненты исследовательского класса были заменены компонентами GMP или клиническими классами. Все оборудование, используемое в производстве hPO, было аттестовано в соответствии со стандартами GMP (Квалификация установки, Квалификация эксплуатации и Квалификация производительности). После выделения среду меняли каждые 3-4 дня, а hPO делили каждые 7 дней. Был приобретен человеческий RSPO1 (1 мкг/мл, R&D System, исх.4645-RS-01 M, Миннеаполис, Миннесота) и RSPO1 CM получали, как описано ранее [23].

Криоконсервация

hPO были собраны и механически диссоциированы на фрагменты. Затем ~ 200 000 клеток ресуспендировали в растворе, содержащем 0,9% NaCl (Fresenius Kabi MAH 035725035, Bad Homburg vor der Höhe, Германия) с 10% (по объему) диметилсульфоксида (Mylan, ref. 67457-178-50, Canonsburg, PA). ) и 10% (по объему) сывороточного альбумина человека (Kedrion, MAH 022515163, Барга, Италия). Суспензии подвергали криоконсервации в сертифицированном Planer Kryo 360-3 с регулируемой скоростью.3 морозильника (Planer Products PLC, Миддлсекс, Великобритания). Органоиды хранили в жидком азоте до 6 месяцев перед экспериментами по оттаиванию.

Кривая роста in vitro

В конце каждого пассажа hPO диссоциировали путем трипсинизации с 0,5 мл трипла (Life Technologies ref. 12604013, Монца, Италия) в течение 5 мин. Суспензии одиночных клеток подсчитывали непосредственно с помощью одобренного GMP Nucleocounter® NC-100™ (ChemoMetec, Allerod, Дания), как описано ранее [28]. Двадцать тысяч клеток помещали в каплю 50 мкл BME2, культивировали в среде для размножения, подсчитывали и повторно засевали каждые 2 недели.

Анализ кариотипа

Фрагменты hPO из конфлюэнтных культур разделяли в соотношении 1:8 и оставляли для роста на 4 дня, а затем обрабатывали для метафазного анализа. Традиционное кариотипирование проводили методом Q-бэндинга по стандартным лабораторным протоколам. Числовые и структурные аномалии анализировали на уровне 400 полос в соответствии с международной системой цитогеномной номенклатуры человека и европейскими общими рекомендациями и обеспечением качества для цитогенетики.Анализ включал как минимум 20 клеток с остановкой метафазы, чтобы исключить клональные реаранжировки. Захват изображения метафазы выполняли с помощью автоматизированной системы анализа образцов IKAROS (MetaSystems, Милан, Италия).

Измерение диаметра и площади

Изображения в светлом поле были получены с помощью микроскопа Nikon Eclipse TS100, оснащенного цифровой камерой (Nikon Instrument Europe). hPOs ( n = 10 полей) анализировали при увеличении × 4. Было проведено не менее трех независимых экспериментов от P3 до P5.Диаметр органоида (большая ось) и площадь (область интереса) рассчитывали в программном обеспечении ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Измерение потребления глюкозы и продукции лактата в культурах hPO

Уровни глюкозы и лактата измеряли с помощью измерителей StatStrip® [Nova Biomedicals, ref. 47289 (глюкоза) и исх. 47486 (лактат), Уолтем, Массачусетс]. Количество потребленной глюкозы и лактата, вырабатываемого hPO, рассчитывали с учетом начальных концентраций глюкозы и лактата, соответственно, в свежей среде.В пассажах (P) 3–P5 проводили по три независимых измерения каждого вида.

Проточная цитометрия

hPO и исходный материал диссоциировали путем трипсинизации с Tryple в течение 5 мин для получения суспензии одиночных клеток, и для каждого образца окрашивали 100 000 клеток на пробирку. Клетки центрифугировали в течение 7 мин при 350× g и удаляли супернатант. Для анализа поверхностных маркеров осажденные клетки инкубировали с антителами, конъюгированными с флуорофором, в общем объеме 200 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS, Thermo Fisher Scientific, ref.14190-094, Уолтем, Массачусетс) в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре (КТ), промывают 3 мл PBS и ресуспендируют в 200 мкл PBS для анализа. Для анализа внутриклеточных маркеров осажденные клетки фиксировали в 200 мкл 0,25% параформальдегида (Electron Microscopy Sciences, ref. 15710, Hatfield, PA) в течение 1 часа при комнатной температуре, промывали 3 мл 1% фетальной телячьей сыворотки PBS (Thermo Fisher Scientific, № 10270-106) и пермеабилизированы 200 мкл Perm Buffer III (Becton Dickinson, № 558050, Франклин Лейкс, Нью-Джерси) в соответствии с инструкциями производителя.Затем фиксированные и пермеабилизированные клетки окрашивали и готовили к анализу, как описано выше. Моноклональные антитела, использованные в анализе фенотипа, перечислены в дополнительном файле 1: таблица S2. Образцы анализировали на цитометре FACSCanto II с программным обеспечением для анализа FACSDiva (Becton Dickinson). Полученные события были нанесены на график в зависимости от высоты прямого рассеяния и площади прямого рассеяния, чтобы исключить дублеты клеток (ворота P1), а затем в зависимости от физических параметров площади прямого и бокового рассеяния, чтобы выбрать гомогенные клеточные популяции, исключая дебрис (ворота P2). Было получено не менее 10 000 событий P2. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью окрашивания 7-аминоактиномицином D (Becton Dickinson). Интересующие маркеры измеряли на гистограммах или точечных диаграммах с помощью аналитического гейта (P3) для маркер-положительных событий.

Экстракция и анализ РНК

Тотальную РНК экстрагировали из hPO с помощью реагента TRIzol (Ambion, ref. 15596026, Huntingdon, UK), определяли количество и проверяли качество с помощью спектрофотометрии NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Для анализа qRT-PCR кДНК синтезировали из 500 нг тотальной РНК с помощью SuperScript IV VILO (Invitrogen, ref.11756500, Карлсбад, Калифорния). Полученную кДНК разбавляли 1:10 и 1 мкл использовали в качестве матрицы для количественного анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR) с помощью PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, ref. A15780, Foster City, CA) в термоциклер CFX96 (BioRad, Hercules, CA). Для каждой пары праймеров (дополнительный файл 1: таблица S3) эффективность амплификации оценивали в соответствии с рекомендациями MIQE [29]. Относительные уровни экспрессии генов определяли методом ΔΔCt; данные были нормализованы к средним геометрическим уровням эндогенной мРНК ACTB и TBP .

Иммунофлуоресцентный анализ

Перед иммунофлуоресцентным окрашиванием hPO ненадолго промывали PBS и фиксировали 4% PFA (Electron Microscopy Science, ref. 15,710, Hatfield, PA) в PBS в течение 40 мин на льду. После этого их промывали PBS, а остаток BME2 удаляли раствором для восстановления клеток (Corning, ссылка 354253, Corning, NY). Затем hPO пермеабилизировали 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 40 минут при комнатной температуре, снова промывали и инкубировали три раза в течение 10 минут со 100 мМ глицина в PBS при комнатной температуре.После очередной промывки их блокировали на 12 часов при комнатной температуре блокирующим раствором [0,1% BSA (Sigma-Aldrich, арт. A8327, Милан, Италия), 0,2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, арт. T8787, Милан, Италия). Италия), 0,05% Tween-20 (Sigma-Aldrich, арт. P7949, Милан, Италия) и 10% козьей сыворотки (Life Technologies, арт. 16210-064, Монца, Италия) в PBS]. Образцы инкубировали с разведенными в блокирующем растворе первичными антителами в течение 24 ч при 37°С на шейкере. Затем их тщательно промывали PBS и инкубировали со вторичными антителами и DAPI (Thermo Fisher; 1 мкг/мл в PBS) в течение 2 часов при 27 °C.Образцы быстро промывали и переносили в 96-луночный планшет перед получением изображений с помощью микроскопа (Zeiss LSM780).

Статистический анализ

Результаты выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Данные диаметра, площади и проточной цитометрии подвергали двустороннему дисперсионному анализу (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Ньюмана-Кеулса для множественных сравнений. Данные экспрессии генов подвергали тестам Стьюдента t . Все статистические анализы проводились в программе Prism версии 4.0 (Графпад, Сан-Диего, Калифорния). P — значения < 0,05 считались значимыми.

Транспортировка при комнатной температуре не влияет на биологическую активность органоидов сетчатки, полученных из плюрипотентных стволовых клеток

Abstract

Получение многослойных и чувствительных к свету органоидов сетчатки из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) представляет собой мощный инструмент для изучения заболеваний сетчатки и разработки лекарств, а также надежную платформу для клеточной терапии. Целью данного исследования является изучение того, могут ли органоиды сетчатки сохранять свои морфологические и функциональные характеристики при хранении в условиях комнатной температуры (КТ) и транспортировке по воздуху с использованием имеющегося в продаже контейнера, в котором поддерживается температура окружающей среды. Морфологический анализ и измерения толщины нейроэпителия не выявили различий между контрольными, инкубированными при комнатной температуре и транспортированными органоидами. Точно так же иммуногистохимический анализ не показал различий в составе типов клеток и их положении в многослойной структуре сетчатки.Все группы показали одинаковую реакцию на свет, что свидетельствует о том, что биологическая функция органоидов сетчатки не была затронута хранением или транспортировкой RT. Эти результаты обеспечивают прогресс в транспортировке готовых органоидов сетчатки, повышая их доступность для многих исследовательских и фармацевтических лабораторий по всему миру и облегчая перекрестные совместные исследования.

Образец цитирования: Георгиу М., Чичагова В., Хильген Г., Доргау Б., Сернагор Э., Армстронг Л. и др. (2020) Перевозка при комнатной температуре не влияет на биологическую активность органоидов сетчатки, полученных из плюрипотентных стволовых клеток.ПЛОС ОДИН 15(6): e0233860. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233860

Редактор: Альфред С. Левин, Университет Флориды, США

Поступила в редакцию: 19 декабря 2019 г.; Принято: 13 мая 2020 г .; Опубликовано: 1 июня 2020 г.

Авторское право: © 2020 Georgiou et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные содержатся в рукописи и файлах вспомогательной информации.

Финансирование: Премия CRACKIT23 (NC/CO16206/1), Европейский исследовательский совет (#614620) Премия MRC Confidence in Concept (MC_PC_15030), грант RP Fighting Blindness Innovation (GR584 и GR585). Факультет медицинских наук Университета Ньюкасла, Великобритания, оказывал поддержку в виде заработной платы авторам MG, BH, VC, но не играл никакой дополнительной роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке исследования. рукопись.Конкретные роли этих авторов сформулированы в разделе «вклад авторов».

Конкурирующие интересы: MG, BH, VC являются оплачиваемыми сотрудниками Newcells Biotech Ltd. Нет никаких патентов, разрабатываемых продуктов или продаваемых продуктов, связанных с этим исследованием, которые необходимо декларировать. Это не меняет нашей приверженности политике PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

1. Введение

Новая технология, а именно крупномасштабное создание трехмерных (3D) органоидов сетчатки, появилась путем дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека (hESC) и индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) в «синтетическую сетчатку» [ 1–3]. Эти трехмерные структуры сетчатки содержат все основные подтипы клеток сетчатки с отчетливой слоистостью, в значительной степени отражающей структурные, морфологические и функциональные свойства сетчатки человека [4]. Этот подход был использован для создания моделей заболеваний, специфичных для пациентов, для лучшего понимания заболеваний сетчатки человека, для получения новых сведений о развитии сетчатки человека, для выявления неизвестных механизмов патогенеза и для обеспечения новых возможностей для скрининга лекарств и заместительной терапии на основе клеток [5]. ].

В то время как технология органоидов доступна некоторым специализированным лабораториям, их создание потребует значительного опыта и инфраструктуры для некоторых других, поэтому транспортировка хорошо охарактеризованных органоидов сетчатки в конечном итоге сделает эту технологию более доступной во всем мире. Условия доставки очень важны для ткани и зависят от контроля температуры и времени [6]. Транспортировка органоидов сетчатки должна обеспечивать немедленную доставку органоидов по кратчайшему маршруту, чтобы сохранить выживаемость, состав клеток, положение и функциональность. Поэтому следует рассмотреть специальные контейнеры, поддерживающие температуру, а также надежные компании по доставке. Это очень важно, так как воздействие на ткани высоких или низких температур или колебаний температуры может быть вредным, влияя на биологическую и механическую активность ткани, вызывая повреждение клеток и внутриклеточную дегенерацию клеток [6]. Таким образом, при мониторинге температурного режима повреждающее воздействие на клетки сводится к минимуму. Для перевозки с контролируемой температурой доступно множество вариантов, но они не всегда экономически практичны [7].Транспортировка тканей зависит от характера образцов, от того, являются ли образцы законсервированными или живыми, а также зависит от способа доставки, будь то авиаперевозка или автомобильный транспорт [6]. В нескольких опубликованных исследованиях сообщается об успешной транспортировке тканей в охлажденном или замороженном состоянии с использованием имеющихся в продаже контейнеров [8, 9]. В частности, в 2013 году исследование с использованием роговицы и крови выявило сохранение температуры охлаждения во время транспортировки органов [9]. Другое исследование продемонстрировало успешную транспортировку тканей головки бедренной кости и ахиллова сухожилия при температуре -40 °C в течение не менее 48 часов, что свидетельствует о том, что безопасность и качество тканей человека могут сохраняться во время транспортировки [8].Хори и его коллеги продемонстрировали новую технологию транспортировки тканей RPE при комнатной температуре с использованием теплоизолирующего контейнера для минимизации физической и химической нагрузки на клетки [10]. Кроме того, в недавнем исследовании был разработан новый протокол доставки органоидов сетчатки при температуре 37°C для облегчения доклинических исследований на животных моделях и, возможно, трансплантации за счет поддержания жизнеспособности ткани и предотвращения ее повреждения [11].

В этом исследовании мы определяем, как хранение органоидов сетчатки и их транспортировка при комнатной температуре (КТ) в норме (0.04%) Уровни CO2 влияют на морфологию органоидов, клеточную динамику и функциональность по сравнению с их поддержанием во влажной среде при 37 °C с 5% CO ₂ .

2. Материалы и методы

2.1. Культура плюрипотентных стволовых клеток

Две контрольные линии hiPSC, WT3 (Ad4) [1] и WT4 (MJN1), культивировали в mTeSR ^™ 1 (StemCell Technologies, 05850) с добавлением пенициллина/стрептомицина (P/S) (Gibco, 15140–122) на 6-луночных планшетах (Corning, NY), предварительно покрытых матригелем с пониженным фактором роста (BD, 354230).Среду для культивирования клеток меняли каждый день, а hiPSC пассировали каждые 4–5 дней с использованием 0,02% Versene EDTA (Lonza BE17-711E) в соотношении 1:6. Клетки содержали во влажной среде при 37 °C с 5% CO ₂ .

2.2. Дифференцировка иПСК человека в органоиды сетчатки

ИПСК человека были дифференцированы в органоиды сетчатки на основе ранее описанного протокола с небольшими модификациями [12]. Вкратце, hiPSC сначала промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и диссоциировали на отдельные клетки с помощью Accutase (Gibco, A1110501).hiPSC высевали с плотностью 7000 клеток/лунку в 96-луночные планшеты с U-образным дном (Helena, 92697T), вручную предварительно покрытые раствором Lipidure (AMSbio, AMS. 52000011GB1G) в mTeSR™1 с 10 мкМ Y-27632 ROCK. ингибитор (Chemdea). Через 2 дня 200 мкл среды для дифференцировки, состоящей из 41 % среды Дульбекко, модифицированной Iscove (IMDM, Gibco, 12440–053), 41 % Hams F12 (Gibco, 31765–029), 15 % замены сыворотки KnockOut (KOSR) (Gibco, 10828–028), 1 % глутамакса (Gibco, 35050–038), 1 % липидного концентрата определенного химического состава (Thermo, 11

1), 225 мкМ монотиоглицерина (Sigma, M6145) и 1 % P/S (Gibco, 15140–122) добавляли на лунку, а через два дня производили половину замены среды.Половину среды для дифференцировки меняли каждые 2 дня. На 6-й день дифференцировки к среде добавляли 2,25 нМ BMP4 (R&D, 314-BP) и после этого среду заменяли каждые 3 дня. На 18-й день среду заменили на реверсивную среду с использованием DMEM/F12, 1% Glutamax, 1% добавки N2 (Thermo, A1370701), 4 мкМ CHIR99021 (Sigma-Aldrich, SML1046-5MG), 2,5 мкМ SU5402 (Tocris, 3300). и 1% P/S, где среду меняли каждые 2 дня. На 24-й день среду заменили на поддерживающую среду, состоящую из DMEM/F12 (Gibco, 31330–038), 5% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 1% добавки N2, 0.

1 мМ таурин (Sigma, T8691), 0,25 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma, R2625), 0,25 мкг/мл фунгизона (Gibco, 15290–02), 1% P/S (Gibco, 15140–122), среду меняли каждые 3 –4 дня после этого.

2.3. Срезы органоидов

Перед срезом органоиды сетчатки собирали и фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 15 минут (Санта-Крус, 30525-89-4) при комнатной температуре с последующими тремя промываниями PBS по 5 минут каждая. Органоиды сетчатки обезвоживали в 30% сахарозе при 4°С в течение ночи.Затем органоиды сетчатки помещали в формы (Tebu-Bio, UK 18985-1) в среду с оптимальной температурой резки (OCT) (Cell Path Ltd., Ньютаун, Великобритания). Образцы разрезали на срезы толщиной 10 мкм с помощью криостата (Leica, CM1860), помещали в порядке очереди на предметные стекла (SuperFrost, Menzel) и хранили при -20 °C.

2.4. Иммуногистохимия (ИГХ)

Органоидные срезы сетчатки разделяли с помощью ручки ImmEdge (VectorLabs, H-4000) и сушили на воздухе в течение 20 минут при комнатной температуре с последующими тремя промываниями PBS в течение 5 минут. Срезы инкубировали с блокирующим раствором (10% козьей/ослиной сыворотки, 0,3% Triton-X в PBS) в течение 1 часа при комнатной температуре. Первичные антитела (таблица S1) разводили в растворе для разведения антител (1% бычий сывороточный альбумин (BSA, Sigma, A9418), 0,3% Triton-X (в PBS) с последующей инкубацией образцов в течение ночи при 4 °C. Срезы трижды промывали PBS в течение 15 минут и вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами (таблица S2), разводили в разбавителе антител и добавляли к срезам на 1 час при комнатной температуре с последующими тремя промываниями PBS.После этого срезы органоидов сетчатки контрастировали ядерным красителем Hoechst (Sigma, B2261), разведенным в Vectashield в соотношении 1:1000 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, H-1000). Неспецифическое окрашивание контролировали включением контрольных групп только с вторичным антителом.

2.4.1 Окрашивание TUNEL.

Предметные стекла, содержащие срезы органоидов сетчатки Ad4 и MJN1, сначала инкубировали с PBS, а затем с протеиназой K. Затем предметные стекла обрабатывали в течение 10 минут 3% H ₂ O ₂ при комнатной температуре.После этого слайды инкубировали с реакционным буфером в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем использовали туннельный анализ в соответствии с инструкциями производителя (Biovision, Mountain View, CA, USA). Апоптотические и некротические клетки выявляли в виде темных частиц с помощью микроскопа Axio Imager со структурированной флуоресценцией освещения Apotome (Zeiss AxioVert 2 Germany).

2.5. RT и отправка органоидов сетчатки

Для эксперимента с RT органоиды сетчатки на 360-й день хранились в условиях RT в течение пяти дней.Начало эксперимента было определено как день -5. После 5 дней инкубации при комнатной температуре органоиды сетчатки переносили в инкубатор при 37°C с 5% CO ₂ ; это определяется как день 0. Органоиды хранились в инкубаторе в течение 15 дней перед их сбором для IHC: это определяется как день 15 эксперимента RT.

Эксперимент по транспортировке проводили в два разных момента времени дифференцировки сетчатки: на 135-й и 160-й день. Перед отправкой в 96-луночные планшеты для культивирования органоидов сетчатки добавляли 100 мкл свежей среды для органоидов сетчатки перед отправкой.96-луночные планшеты были покрыты парафильмом для предотвращения любой утечки и дополнительно запечатаны пластиковым герметичным пакетом, содержащим абсорбирующий материал, и помещены горизонтально в специальный транспортировочный контейнер при комнатной температуре в системе контролируемой окружающей среды (QuickSTAT). Пластины были окружены тканью/салфеткой для предотвращения движения пластин и их утечки в транспортном контейнере. В соответствии с инструкциями производителя внутри коробки был активирован и помещен в коробку регулятор температуры для регистрации температуры во время транспортировки (рис. S1A).

Посылка была доставлена автомобилем в Лондон, а затем самолетом во Франкфурт, Германия, в RT при нормальном уровне CO ₂ (0,04%) (рис. S1B). Это определяется как день -3 эксперимента по отгрузке. Через три дня посылка вернулась обратно в Институт биологических наук в Ньюкасле по тому же маршруту (рис. S1C). Прибытие органоидов сетчатки на 135-й и 160-й день обратно в Институт было зарегистрировано как день 0. Органоиды были помещены в инкубатор при 37°C после доставки, а поддерживающая среда заменялась каждые 2 дня.Сбор органоидов для эксперимента ИГХ проводят после их инкубации в течение 7 дней до восстановления.

Контрольные чашки с органоидами сетчатки на 135, 160 и 360 день выдерживали во влажной среде при 37 °C с 5% CO ₂ для сравнения. Эти контрольные органоиды были собраны в те же моменты времени, что и RT и отправленные органоиды.

2.6. Микроскопия

Цифровые изображения были получены с использованием микроскопа Axio Imager со структурированной флуоресцентной подсветкой Apotome (Zeiss AxioVert 2 Germany).В то время как приблизительно 8–10 органоидов были проанализированы для каждого состояния, для каждого состояния было сделано только пять репрезентативных изображений, которые использовались для дальнейших анализов IHC. Изображения представлены в максимальной проекции и скорректированы по яркости и контрастности в Adobe Photoshop (Adobe Systems). Изображения органоидов сетчатки в светлом поле были получены с помощью Axiovision 4.3 (Zeiss), а анализ толщины нейроэпителия был выполнен с использованием программного обеспечения ImageJ, как описано ранее [13]. Вкратце, толщину нейроэпителия измеряли путем проведения 6 измерений нейроэпителия каждого органоида с использованием 8–10 репрезентативных органоидов из каждого состояния.Среднее значение толщины нейроэпителия из контрольных и РТ-органоидов статистически анализировали с помощью Prism (GraphPad, США).

2.6.1. Количественная оценка изображения.

Количественную оценку типов клеток сетчатки выполняли с использованием программного обеспечения MATLAB (Mathworks, MA), как описано ранее [14]. Используя свойство region props MATLAB, была рассчитана информация о размере, длине и средней интенсивности каждой клетки сетчатки, а общий размер и процент положительных клеток по отношению к клеткам, окрашенным в ядро, были экспортированы в файл Excel для дополнительного анализа. Количественно оценивали от пяти до шести репрезентативных изображений всей структуры сетчатки для каждого состояния. Процент реснитчатых клеток рассчитывали как количество ресничек/общее количество клеток (DAPI) в предполагаемом внешнем ядерном слое x 100.

2.7. Электрофизиологические записи

Электрофизиологическую запись отправленных органоидов сетчатки выполняли, как описано в Dorgau and Felemban et al., 2019 [14]. Вкратце, за 24 часа до регистрации проводили инкубацию с 9-цис ретиналем (10 нМ; Sigma-Aldrich, Великобритания).Органоиды помещали лицевой стороной вниз предполагаемым слоем ганглиозных клеток сетчатки (RGC) на 4096-канальную многоэлектродную матрицу (MEA). Платформа BioCam4096 MEA с BioChips 4096S+ (3Brain GmbH, Lanquart, Швейцария) использовалась для внеклеточной регистрации активности ганглиозных клеток сетчатки в органоидах сетчатки. Импульсы белого света полного поля (WLP, 200 мс, излучение 217 мкВт/см2, 1 Гц) вспыхивали в течение 5 минут на органоиды после регистрации спонтанной активности в темноте в течение 5 минут. Анализ скорострельности выполнялся с использованием MatLab (Mathworks, MA), а тесты статистической значимости (критерий Манна-Уитни) оценивались с использованием Prism (GraphPad, CA).Ганглиозные клетки сетчатки считались реагирующими, если они изменяли свою пиковую активность не менее чем на 25% (увеличение или снижение) в течение 30 секунд после начала WLP по сравнению с аналогичным временным окном до светового стимула (темновые условия).

2.8. Трансмиссионная электронная микроскопия (ПЭМ)

Органоиды сетчатки собирали и фиксировали 2% глутеральдегидом в 0,1 М буфере какодилата натрия и хранили при 4 °C. Образцы обрабатывали в лаборатории электронной микроскопии Университета Ньюкасла, где для дальнейшей фиксации образцов использовали 1% четырехокиси осмия с последующей дегидратацией и заливкой с использованием градиента ацетона и эпоксидной смолы соответственно.Тяжелые металлы (уранилацетат и цитрат свинца) использовались для окрашивания ультратонких срезов (70 нм) на медных сетках, визуализированных на ПЭМ Philips CM100 с цифровым захватом изображения высокого разрешения.

2.9. Статистический анализ

Статистический анализ выполнен с помощью программы Prism (GraphPad, США). Статистическую значимость проверяли с помощью двустороннего критерия Стьюдента t . Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего (SEM), если не указано иное. Статистическая значимость попарных сравнений указана звездочками: * p-значение <0.05, ** p-значение <0,01, *** = p-значение <0,001. *** = р-значение <0,0001.

3. Результаты

3.1. Кратковременное хранение органоидов сетчатки на 360-й день при комнатной температуре не вызывает фенотипических или структурных различий

ИПСК человека были дифференцированы в органоиды сетчатки с использованием установленного протокола (S2 Fig) [12]. Чтобы оценить влияние хранения RT, 360-дневные органоиды хранили вне инкубатора в течение 5 дней (рис. 1А). Яркопольные изображения органоидов сетчатки как из контрольной группы на 360-й день, так и органоидов, сохраняемых при RT, были получены на -5, 0 и 15-й день эксперимента RT (рис. 1B), не показывая морфологических изменений между контрольной группой и группой RT.Измерение толщины нейроэпителия светлой фазы не выявило существенных различий между двумя группами (рис. 1С).

Рис. 1. Морфологические характеристики контрольных и ретинальных органоидов сетчатки до и после воздействия условий ЛТ.

(A) Схема эксперимента RT. (B) Репрезентативные примеры органоидов сетчатки, полученных из hiPSCs, на 360-й день дифференцировки. Верхние изображения представляют собой контрольные органоиды сетчатки, которые оставались во влажной среде при 37°C с 5% CO ₂ .Нижние изображения представляют органоиды сетчатки, которые хранились при комнатной температуре в течение 5 дней. День -5 представляет собой первый день хранения органоидов при комнатной температуре, день 0 представляет собой день, когда органоиды были перенесены в инкубатор при 37 ° C с 5% CO ₂ , а день 15 представляет собой период восстановления органоидов до их сбор во влажной среде при 37°C с 5% CO ₂ . Шкала баров = 100 мкм. (C) Толщина нейроэпителиального слоя по всему органоиду измерялась в мкм с использованием программного обеспечения ImageJ.Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 8 репрезентативных органоидов из каждой группы. Непарный t-критерий был проведен для оценки различий в толщине нейроэпителия между контрольными и RT органоидами, не показывающими существенных различий между группами (p = 0,3713). (D) Иммуногистохимический анализ маркеров сетчатки контрольных и ретинальных органоидов сетчатки после 15 дней восстановления после хранения при комнатной температуре в течение 5 дней. Экспрессия фоторецепторов (Рековерин, зеленый) и амакриновых и ганглиозных клеток (HuC/D, красный), клеток Мюллера (виментин–зеленый, Sox9-красный), биполярных клеток (PKCα, красный), фоторецепторов палочек (родопсин, зеленый), ганглиозных клетки (SNCG, зеленый), амакриновые клетки (AP2α, красный) и фоторецепторы колбочек S (Opsin SW, зеленый), фоторецепторы колбочек L / M (Opsin MW / LW, зеленый) и горизонтальные клетки (Prox1, зеленый). Ядра контрастируют Hoechst (Hoe, синий). Масштабная линейка = 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233860.g001

Морфологию и структуру органоидов сетчатки на 360-й день подробно оценивали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания, которое выявило присутствие всех ключевых типов клеток сетчатки в контроле и при комнатной температуре. условиях (рис. 1D, S3 рис.). Экспрессия панфоторецепторного маркера рековерина наблюдалась в апикальном участке органоидов (рис. 1D, рис. S3), в то время как HuC/D-положительные клетки, представляющие собой ганглиозные и амакриновые клетки, в основном располагались в базальном слое органоидов (рис. 1D, S3 рис).Кроме того, иммуноокрашивание на гамма-синуклеин (SNCG) использовалось для идентификации предполагаемых ганглиозных клеток сетчатки (рис. 1D, рис. S3). Все типы колбочек, длинноволновые/средневолновые и коротковолновые (ДВ/СВ и КВ), также были обнаружены в обоих условиях (рис. 1D, рис. S3). Палочковые фоторецепторные клетки идентифицировали родопсином в апикальном слое контрольных и RT органоидов (рис. 1D, рис. S3). Присутствие клеток глии Мюллера было подтверждено окрашиванием нейрофиламентов виментином, которые простирались по всей сетчатке, и окрашиванием Sox9 ядра клеток глии Мюллера (рис. 1D, рис. S3).Биполярные и амакриновые клетки, идентифицированные PKCα и AP2α соответственно, также были идентифицированы в обоих состояниях (рис. 1D, рис. S3). Предполагаемые горизонтальные клетки, обнаруженные с помощью антитела Prox1, были в основном обнаружены в среднем слое органоидов (рис. 1D, рис. S3). Количественный анализ клеток рековерина, HuC/D, PKCα, родопсина, SNCG, опсина MW/LW, AP2α, Prox1, ARL13B и опсина SW не выявил существенных различий между двумя состояниями (рис. 2А). ТЭМ 360-го дня контроля и RT органоидов выявила наличие развивающихся наружных сегментов (OS), внутренних сегментов (IS), наружной лимитирующей мембраны (OLM), соединительных ресничек (cc), базального тела (bb) и митохондрий (mt). в обоих условиях (рис. 2B).Кроме того, апоптотические и некротические клетки или стрессовые вакуоли были идентифицированы как в контроле, так и в условиях RT с использованием окрашивания Tunel (рис. 2C), что не выявило существенных различий между двумя группами. Таким образом, эти результаты показывают, что культивирование органоидов сетчатки в течение по крайней мере 5 дней при комнатной температуре не влияет на их структуру и морфологию.

Рис. 2. Анализ 360-дневного контроля и ретинальных органоидов.

(A) Количественный анализ иммунопозитивных клеток в контроле и RT органоидах.Рековерин (p = 0,4766), HuC/D (p = 0,3463), PKCa (p = 0,6996), Родопсин (p = 0,1608), SNCG (p = 0,1254), AP2α (p = 0,1506), Opsin SW (p = 0,2012) ), Opsin MW/LW (P = 0,5941) и Prox1 (P = 0,0624), анализ не выявил существенной разницы в проценте иммунореактивно-позитивных клеток между контролем и условиями RT. Данные представлены как среднее ± SEM, n = 5 репрезентативных изображений на клеточный маркер были количественно определены для каждого состояния. (B) Ультраструктурный анализ восстановленных RT и контрольных органоидов сетчатки выявил наличие наружных сегментов фоторецепторов (OS), внутренних сегментов фоторецепторов (IS), соединяющих ресничку (CC), базальное тело (bb), внешнюю пограничную мембрану (OLM) и митохондрии. (мт).(C) Светлопольные изображения апоптотических клеток, окрашенных в темно-коричневый цвет, обозначенных красными стрелками, в контроле (левое изображение) и RT (правое изображение). Количественный анализ апоптотических клеток не показал существенных различий между двумя состояниями (p = 0,8442). Масштабная линейка = 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233860.g002

3.2. Транспортировка органоидов в условиях КТ

После успешного хранения органоидов сетчатки в течение 5 дней при комнатной температуре мы исследовали возможность их отправки в другую страну в контролируемой среде (рис. S1A).Таким образом, органоиды в возрасте 135 и 160 дней были доставлены из нашей лаборатории в Ньюкасле во Франкфурт по воздуху, а затем обратно в лабораторию при температуре окружающей среды с использованием контроля температуры для контроля температуры окружающей среды (рис. S1A и S1B). По прибытии в нашу лабораторию органоиды помещали в инкубатор на 7 дней и сравнивали с контрольной группой, которая содержалась в стандартных условиях культивирования (рис. 3А).

Рис. 3. Характеристика органоидов сетчатки на 135-й день после отправки.

(A) Схематическая диаграмма эксперимента по отгрузке. (B) Светлопольные изображения органоидов сетчатки, полученных из hiPSCs на 135-й день, были захвачены на -3 день, представляя органоиды перед отправкой, день 0, прибытие отправленных органоидов, и день 7 представляет период восстановления органоидов во влажной среде при 37°C с 5% CO ₂ . Шкала баров = 100 мкм. (C) Толщина нейропителия на 135-й день доставки органоидов сетчатки по сравнению с контрольными органоидами. Данные представлены как среднее ± SEM.Статистический анализ проводили с использованием непарного t-критерия. Статистически значимых различий между двумя группами не наблюдалось, p = 0,4104. (D) Экспрессия маркеров сетчатки как в контрольных, так и в доставленных органоидах сетчатки выявила присутствие фоторецепторов (рековерин, зеленый), фоторецепторов палочек (родопсин, зеленый), амакриновых клеток (AP2α, красный), амакриновых и ганглиозных клеток (HuC/D, красный), ганглиозные клетки (SNCG), соединительная ресничка (ARL13B красный), клетки Мюллера (виментин – зеленый, Sox9 – красный) и горизонтальные клетки (Prox1, зеленый). Ядра контрастировали Hoechst (Hoe, синий). Масштабная линейка = 50 мкм. (E) Графики количественной оценки рековерина (p = 0,1120), AP2α (p = 0,7156), HuC/D (p = 0,5570), ARL13B (p = 0,2566), SNCG (p = 0,4259), Prox1 (p = 0,2329) и Родопсин (р = 0,5804) не выявил достоверной разницы в процентном содержании иммунореактивно-позитивных клеток между контролем и условиями ЛТ. Данные представлены как среднее ± SEM, n = 3–6 репрезентативных изображений на клеточный маркер были количественно определены для каждого состояния.

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0233860.g003

3.2.1. Сравнение контрольных и отправленных органоидов на 135-й день.

Светлопольные изображения органоидов на 135-й день были сделаны для оценки морфологии и толщины нейроэпителия. Структура и толщина нейроэпителия отправленных органоидов не выявили существенных различий по сравнению с контрольными органоидами на 135-й день (рис. 3B и 3C). Иммуногистохимический анализ не выявил существенных различий в процентном соотношении и положении рековерин-положительных фоторецепторов (фиг. 3D и 3E, фиг. S4).Небольшой процент клеток, идентифицированных в среднем слое органоидов на 135-й день, был положительным в отношении клеток AP2α в обоих условиях, что указывает на присутствие амакриновых клеток (фиг. 3D и 3E, фиг. S4). Кроме того, клетки, положительные по HuC/D, маркеру амакриновых и ганглиозных клеток, присутствовали в центре органоидов сетчатки в обоих состояниях (рис. 3D, рис. S4). Присутствие ганглиозных клеток также было обнаружено с помощью маркера SNCG (фиг. 3D, фиг. S4). ARL13B был обнаружен на апикальной стороне над ядрами фоторецепторных клеток контрольных и доставленных органоидов, что указывает на образование соединительных ресничек (фиг. 3D, фиг. S4).Виментин и иммуноположительные клетки Sox9 и Prox1 присутствовали в обоих условиях, что указывает на присутствие глиальных и горизонтальных клеток Мюллера соответственно (рис. 3D, рис. S4). Экспрессия фоторецепторов Rod была обнаружена с помощью родопсина в обоих условиях (фиг. 3D, фиг. S4). В целом количественный анализ всех маркеров сетчатки не показал существенных различий между отправленными и контрольными органоидами (рис. 3D, рис. S4). Кроме того, количество мертвых клеток в контроле и условиях RT было обнаружено с помощью анализа Tunel, который не показал существенных различий между двумя группами (рис. 4A).

Рис. 4. Апоптотические клетки и функциональность 135-дневных восстановленных органоидов сетчатки.

(A) Светлопольные изображения апоптотических и некротических клеток были обнаружены в контроле (левое изображение) и отправленных органоидах (правое изображение), окрашенных в темно-коричневый цвет, обозначенных красными стрелками. Существенных различий между контрольными и отправленными органоидами не наблюдалось (p = 0,9355). (B) Растровые графики всплесков (вверху) и гистограмма скорости срабатывания (внизу) предполагаемых ВЫКЛЮЧЕННЫХ ганглиозных клеток сетчатки (RGC) контрольных и отправленных органоидов d135 показали, что их пиковая активность снижалась после импульсов белого света (WLP).Каждая строка на растровом графике (ось Y) представляет собой отдельный RGC, а каждая вертикальная полоса представляет пик от соответствующего RGC. Красная линия иллюстрирует начало стимула, тогда как левая половина до указывает на спонтанную активность до воздействия WLP, а правая половина — при воздействии WLP. Коробчатая диаграмма показывает снижение скорости срабатывания (в %) предполагаемых выключенных RGC (вверху) и включенных RGC (внизу) в контроле и условиях RT. В обоих случаях достоверных различий не наблюдалось (критерий Манна-Уитни; p = 0.77 для выключенных RGC и p = 0,18 для включенных RGC). На блочной диаграмме показана медиана (красная линия).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233860.g004

Чтобы проверить, повлияла ли отправка на физиологическую функциональность органоидов сетчатки, были выполнены многоэлектродные записи для органоидов на 135-й день, которые были отправлены и помещены в инкубатор. еще на 45 дней. В обоих случаях предполагаемое выключение ганглиозных клеток сетчатки (RGC) показало снижение их пиковой активности после импульсов белого света (WLP) (рис. 4B), что указывает на отсутствие существенной разницы между двумя группами (рис. 4B; p = 0.77). Точно так же предполагаемые ON RGC, которые увеличивают свою пиковую активность при воздействии WLP, не показали различий между обоими условиями (рис. 4B; p = 0,18). В совокупности эти результаты подтверждают, что органоиды сетчатки на 135-й день могут сохранять свою структуру, морфологию и функцию после транспортировки в условиях КТ.

3.2.2. Сравнение контрольных и доставленных органоидов на 160-й день.

Затем мы использовали органоиды сетчатки на 160-й день дифференцировки, чтобы проверить, будут ли затронуты пересылкой органоиды на более продвинутой стадии дифференцировки (рис. 5А).Морфология и толщина нейроэпителия отправленных и контрольных органоидов не показали существенных различий (рис. 5B и 5C). Иммуногистохимический анализ выявил наличие рековерин-позитивных фоторецепторов в апикальном слое как в контрольной, так и в транспортной группах (рис. 5D, рис. S5). AP2α-положительные клетки были обнаружены в среднем слое, что указывает на наличие амакриновых клеток (фиг. 5D, фиг. S5). HuC/D и SNCG экспрессировались в базальном слое как контрольных, так и поставляемых органоидов сетчатки (рис. 5D, рис. S5).Небольшой процент Prox1-позитивных клеток (горизонтальные клетки) наблюдался как в отправленных, так и в контрольных органоидах (рис. 5D и 5E, рис. S5). Также было обнаружено, что клетки глии Мюллера, идентифицированные с помощью Vimentin и Sox9, охватывают длину контрольных и отправленных органоидов (рис. 5D, S5). Кроме того, ARL13B-положительные реснички наблюдались в апикальном слое над ядрами фоторецепторов в обеих группах, что свидетельствует о наличии соединительных ресничек и начале формирования наружных сегментов (рис. 5D, рис. S5). Палочковые фоторецепторы были обнаружены с помощью родопсина в апикальном слое в обоих условиях (фиг. 5D, фиг. S5).Количественная оценка всех маркеров не выявила существенных различий в проценте положительных клеток между двумя состояниями (фиг. 5E). Анализ Tunel использовался для определения количества апоптотических и некротических клеток в контроле и отправленных органоидах, которые указаны красными стрелками, не показывая существенных различий между двумя состояниями (фиг. 6A). Для оценки влияния отгрузки органоидов на их физиологическую функцию в ответ на световую стимуляцию проводились многоэлектродные записи.Через 20 дней инкубации после доставки отправленные и контрольные органоиды сетчатки продемонстрировали сходные реакции ганглиозных клеток сетчатки. Например, предполагаемые ответы RGC с выключенным центром показали снижение их пиковой активности в обоих условиях, а также предполагаемые ответы RGC с включенным центром, которые увеличивают их пиковую активность после воздействия света (рис. 6B). Не было значимой разницы между контрольной и отправленной группой (ответы «ВЫКЛЮЧЕННЫЙ центр»: p = 0,56, «Включенные ответы центра» p = 0.86; Рис. 6B), что указывает на то, что отправка органоидов сетчатки на 160-й день не влияет на их функцию. Вместе эти данные свидетельствуют о том, что краткосрочное хранение и транспортировка органоидов сетчатки не влияет на их структуру, морфологию или функцию.

Рис. 5. Характеристика органоидов сетчатки на 160-й день после отправки.

(A) Схематическая диаграмма эксперимента по отгрузке. (B) Светлопольные изображения органоидов сетчатки, полученных из hiPSCs на 160-й день, были получены на -3-й день, представляя органоиды перед отправкой, 0-й день прибытия отправленных органоидов, а 7-й день представляет собой период восстановления органоидов во влажной среде на 37. °C с 5% CO ₂ .Шкала баров = 100 мкм. (C) Измерение толщины нейроэпителия на 160-й день отправленных и контрольных органоидов. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего, а толщина измеряется в мкм. Непарный t-критерий был проведен для оценки различий в толщине апикального слоя между контрольными и RT органоидами, что указывает на отсутствие существенных различий между двумя группами, p = 0,1328. (D) Экспрессия ретинального маркера фоторецепторов (рековерин, зеленый), амакриновых клеток (AP2α, красный), амакриновых и ганглиозных клеток (HuC/D, красный), ганглиозных клеток (SNCG, зеленый), соединительной реснички (ARL13B красный), Клетки Мюллера (виментин-зеленый, Sox9-красный), фоторецепторы палочки (родопсин, зеленый) и горизонтальные клетки (Prox1, зеленый) в контроле и условиях РТ. Ядра контрастировали Hoechst (Hoe, синий). Масштабная линейка = 50 мкм. (E) Количественная оценка экспрессии маркерного белка сетчатки для рековерина (p = 0,2648), AP2α (p = 0,4005), HuC/D (p = 0,1785), SNCG (p = 0,1594), ARL13B (p = 0,6913), родопсина (p = 0,7023) и Prox1 (p = 0,1785) не выявили существенной разницы в процентном содержании иммунореактивно-позитивных клеток между контрольными и отправленными органоидами. Данные представлены как среднее ± SEM. Для каждого условия количественно определяли 3–5 репрезентативных изображений на клеточный маркер.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233860.g005

Рис. 6. Апоптотические клетки, функциональность и ультраструктурные характеристики 160-дневных извлеченных органоидов сетчатки.

(A) На изображениях в светлом поле красными стрелками показаны апоптотические и некротические клетки в контроле (левое изображение) и отправленные органоиды (правое изображение), окрашенные в темно-коричневый цвет. Существенных различий между контрольными и отгруженными органоидами на 165-й день не наблюдалось (p = 0,1888). (B) Растровые графики всплесков (вверху) и гистограмма скорости стрельбы (внизу) от предполагаемых ВЫКЛЮЧЕННЫХ RGC контрольной группы и группы доставки (день 160) показали снижение активности спайков после импульсов белого света (WLP). Коробчатая диаграмма показала снижение скорости срабатывания (в %) предполагаемых выключенных RGC (вверху) и включенных RGC (внизу) в контроле и условиях RT. Между обоими состояниями нет существенных различий (критерий Манна-Уитни; p = 0,56 для выключенных RGC и p = 0,86 для включенных RGC). На блочной диаграмме показана медиана (красная линия). (C) Ультраструктурный анализ органоидов сетчатки на 160-й день выявил наличие соединительной реснички (CC), базального тельца (bb), наружных сегментов фоторецепторов (OS), фоторецепторов, обладающих внутренними сегментами (IS), внешней пограничной мембраны (OLM) и митохондрий ( mt) как в доставленных, так и в контрольных органоидах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233860.g006

ПЭМ контрольных и отправленных органоидов на 160-й день выявила наличие организованных фоторецептороподобных ультраструктурных особенностей, включая OS фоторецептора, IS, соединительную ресничку и наружную ограничивающую мембрана, находящаяся в апикальном слое органоидов сетчатки (рис. 6С). Кроме того, наблюдались базальные тельца, расположенные у основания соединительной реснички, и фоторецепторы, богатые митохондриями (рис. 6С). Эти результаты подтвердили предыдущие выводы и показали отсутствие ультраструктурных различий между RT и контрольными органоидами.

4. Обсуждение

За последнее десятилетие в нескольких ключевых исследованиях [1, 2, 15] сообщалось об улучшениях в образовании органоидов сетчатки из hiPSCs, что привело к образованию 3D агрегатов, которые напоминают сетчатку взрослых с точки зрения клеток. типовой состав и слоистость и в некоторой степени электрофизиологическая функция [1, 4, 16]. Создание органоидов требует навыков и знаний, которые могут быть доступны не в каждой лаборатории; таким образом, проверка наиболее оптимальных условий транспортировки, которые сохраняют свою структуру и функцию, очень важна для обеспечения применения во всем мире в исследованиях, основанных на открытии лекарств и клеточной терапии.

В этом исследовании мы исследовали влияние пятидневного хранения и трехдневной транспортировки при комнатной температуре на органоиды сетчатки. Наши результаты показали, что органоиды сетчатки, полученные из двух разных линий hiPSC, сохранили свою морфологию в условиях RT после последующего периода восстановления. Кроме того, исследование подтвердило, что доставка органоидов сетчатки на разных стадиях развития не влияла на структуру, морфологию, биологическую активность или физиологические функции, что обеспечивает оптимальное решение для расширения их применения в большом количестве лабораторий.

Использование специальных контейнеров, контролирующих и поддерживающих температуру окружающей среды, предотвращает колебания температуры и, таким образом, минимизирует риск гибели клеток или функционального нарушения тканей. Важно отметить, что поддержание органоидов в условиях RT способствует быстрому периоду восстановления, позволяя проводить эксперименты и тесты быстрее, избегая потери времени, структурных повреждений и эффектов токсичности, связанных с криоконсервацией [17].

В заключение, наши данные показывают, что RT-пересылка органоидов сетчатки с использованием контейнера с контролируемой средой сохраняет их структурные особенности и биологическую активность. Таким образом, доставка в режиме реального времени в RT может стать предпочтительным методом для обеспечения сотрудничества между лабораториями. Время восстановления органоидов короткое, а затраты на транспортировку низкие, что делает его оптимальным и экономически эффективным решением для широкого применения в исследованиях и клеточной терапии.

Вспомогательная информация

S3 Рис. Иммуногистохимический анализ ретинальных маркеров контрольных и ретинальных органоидов сетчатки, показанных на рис. 1, в разделенных каналах, после 15 дней восстановления после хранения при комнатной температуре в течение 5 дней.

Экспрессия фоторецепторов (Рековерин, зеленый) и амакриновых и ганглиозных клеток (HuC/D, красный), клеток Мюллера (виментин–зеленый, Sox9-красный), биполярных клеток (PKCα, красный), фоторецепторов палочек (родопсин, зеленый) , ганглиозные клетки (SNCG, зеленый), амакриновые клетки (AP2α, красный) и фоторецепторы колбочек S (Opsin SW, зеленый), фоторецепторы колбочек L/M (Opsin MW/LW, зеленый) и горизонтальные клетки (Prox1, зеленый). Ядра контрастируют Hoechst (Hoe, синий). Масштабная линейка = 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233860.s003

(TIF)

S4 Рис. Иммуногистохимический анализ маркеров сетчатки контрольных и отправленных органоидов сетчатки на 135-й день, показанных на фиг. 3, в разделенных каналах.

Экспрессия маркеров сетчатки как в контрольных, так и в поставляемых органоидах сетчатки выявила наличие фоторецепторов (рековерин, зеленый), фоторецепторов палочек (родопсин, зеленый), амакриновых клеток (AP2α, красный), амакриновых и ганглиозных клеток (HuC/D, красный ), ганглиозные клетки (SNCG), соединительная ресничка (ARL13B красный), клетки Мюллера (виментин-зеленый, Sox9-красный) и горизонтальные клетки (Prox1, зеленый).Ядра контрастировали Hoechst (Hoe, синий). Масштабная линейка = 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233860.s004

(TIF)

S5 Рис. Иммуногистохимический анализ маркеров сетчатки контрольных и отправленных органоидов сетчатки на 160-й день, показанных на фиг.

5, в разделенных каналах.

Экспрессия ретинального маркера фоторецепторов (Рековерин, зеленый), амакриновых клеток (AP2α, красный), амакриновых и ганглиозных клеток (HuC/D, красный), ганглиозных клеток (SNCG, зеленый), соединительной реснички (ARL13B красный), Мюллера клетки (виментин – зеленый, Sox9 – красный), фоторецепторы палочек (родопсин, зеленый) и горизонтальные клетки (Prox1, зеленый) в контроле и условиях РТ.Ядра контрастировали Hoechst (Hoe, синий). Масштабная линейка = 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233860.s005

(TIF)

Благодарности

Эта работа финансировалась наградой CRACKIT23 (NC/CO16206/1), Европейским исследовательским советом (#614620), премией MRC Confidence in Concept (MC_PC_15030) и грантом RP Fighting Blindness Innovation (GR584 и GR585).

Авторы благодарны д-ру Кэтрин Уайт за помощь в анализе ПЭМ, Лизе Ходжсон за помощь в микроскопии и членам группы Лако за плодотворные обсуждения.

Каталожные номера

1. Hallam D, Hilgen G, Dorgau B, Zhu L, Yu M, Bojic S, et al. Плюрипотентные стволовые клетки, индуцированные человеком, генерируют чувствительные к свету органоиды сетчатки с переменной и зависящей от питательных веществ эффективностью. Стволовые клетки. 2018;36(10):1535–51.
2. Меллоу С.Б., Коллин Дж., Куин Р., Хилген Г., Доргау Б., Зерти Д. и др. Систематическое сравнение дифференциации органоидов сетчатки от плюрипотентных стволовых клеток человека выявляет стадийные, клеточные и методологические различия.Стволовые клетки Transl Med. 2019;8(7):694–706.
3. Мейер Дж.С., Ширер Р.Л., Каповски Э.Е., Райт Л.С., Уоллес К.А., Макмиллан Э.Л. и другие. Моделирование раннего развития сетчатки с помощью эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(39):16698–703.
4. Ахбергер К., Хадерспек Дж. К., Клегер А., Либау С. Модели сетчатки на основе стволовых клеток. Adv Drug Deliv Rev. 2019; 140:33–50.
5. Guo Y, Wang P, Ma JH, Cui Z, Yu Q, Liu S, et al.Моделирование пигментного ретинита: органоиды сетчатки, полученные из иПСК пациента с мутацией USh3A, демонстрируют ранние аномалии развития. Границы клеточной неврологии. 2019;13.
6. Шалленбергер М., Ловик Х., Локк Дж., Мейер Т., Джуда Г. Влияние температурного воздействия во время транспортировки на имеющуюся в продаже деминерализованную замазку костного матрикса. Банк клеточных тканей. 2016;17(4):677–87.
7. Эллиот М.А., Халберт Г.В. Поддержание среды доставки холодовой цепи для распространения клинических испытаний фазы I.Инт Дж Фарм. 2005; 299(1–2):49–54.
8. Руни П., Игл М.Дж., Кирни Д.Н. Валидация среды доставки холодовой цепи для транспортировки аллотрансплантатов в рамках политики возврата банка тканей человека. Банк клеточных тканей. 2015;16(4):553–8.
9. Миллер Т.Д., Максвелл А. Дж., Линдквист Т.Д., Реквард Дж. Проверка охлаждающего эффекта изолированных контейнеров для перевозки тканей роговицы и рекомендации по транспортировке. Роговица. 2013;32(1):63–9.
10. Хори К., Кувабара Дж., Танака Ю., Нисида М., Коиде Н., Такахаши М.Простая и статическая система консервации для транспортировки слоев клеток пигментного эпителия сетчатки. J Tissue Eng Regen Med. 2019;13(3):459–68.
11. Сингх Р.К., Винклер П., Бинетт Ф., Гликман Р.Д., Зайлер М., Петерсен-Джонс С.М. и др. Разработка протокола для поддержания жизнеспособности при транспортировке ткани сетчатки, полученной из органоидов. J Tissue Eng Regen Med. 2020;14(2):388–94.
12. Кувахара А., Озон С., Накано Т., Сайто К., Эйраку М., Сасаи Ю. Создание ниши стволовых клеток, похожей на край реснички, из самоорганизующейся ткани сетчатки человека.Нац коммун. 2015;6:6286.
13. Фелембан М., Доргау Б., Хант Н.К., Халлам Д., Зерти Д., Бауэр Р. и др. Экспрессия компонентов внеклеточного матрикса в органоидах сетчатки человека, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, резюмирует ретиногенез in vivo и выявляет важную роль IMPG1 и CD44 в развитии фоторецепторов и межфоторецепторного матрикса. Акта Биоматер. 2018;74:207–21.
14. Доргау Б., Фелембан М., Хильген Г., Кининг М., Зерти Д., Хант Н.К. и др.Децеллюляризованные пептиды, полученные из внеклеточного матрикса, из нервной сетчатки и пигментного эпителия сетчатки усиливают экспрессию синаптических маркеров и светочувствительность органоидов сетчатки, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека. Биоматериалы. 2019;199:63–75.
15. Меллоу С.Б., Бауэр Р., Коллин Дж., Доргау Б., Зерти Д., Долан Д.В.П. и др. Комплексный транскрипционный анализ развивающейся сетчатки человека. Разработка. 2019;146(2).
16. Чичагова В., Халлам Д., Коллин Дж., Зерти Д., Доргау Б., Фелембан М. и др.Стратегии клеточной регенерации при дегенерации желтого пятна: прошлое, настоящее и будущее. Глаз (Лонд). 2018;32(5):946–71.
17. Jang TH, Park SC, Yang JH, Kim JY, Seok JH, Park US и др. Криоконсервация и ее клиническое применение. Интегр Мед Рез. 2017;6(1):12–8.

Объединение технологий органоидов и органов на чипе для создания сложных многослойных моделей тканей на платформе сетчатки глаза человека на чипе

Благодарим вас за представление статьи «Объединение технологий органоидов и органов на чипе для создания сложных многослойных моделей тканей на платформе Retina-on-a-Chip человека» на рассмотрение eLife .Ваша статья была проверена тремя рецензентами, в том числе Миликой Радишич в качестве редактора-рецензента и рецензентом №1, а оценка проводилась под контролем редактора-рецензента и Марианны Броннер в качестве старшего редактора.

Рецензенты обсудили обзоры друг с другом, и редактор-рецензент составил проект этого решения, чтобы помочь вам подготовить исправленное представление.

Резюме:

В этой статье описывается разработка модели сетчатки глаза «орган-на-чипе». Бумага находится в авангарде органа на поле чипов.Сетчатку особенно сложно моделировать из-за большого количества различных типов клеток и сложной структурной организации. В этой статье описывается интеграция более семи различных типов клеток, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, в сосудистую систему, подобную перфузии.

Важно отметить, что авторы объединили органоиды с инженерией органов на чипе. Это представляет собой высокую степень новизны, поскольку это обычно не делается. Они объединили органоиды сетчатки, полученные из hiPSC, с клетками пигментного эпителия сетчатки, полученными из hiPSC, в устройстве сетчатки на чипе (RoC) на основе PDMS.Каждое устройство имело четыре идентичные микроткани, соединенные микроканалом, объединяющим два прозрачных и биосовместимых полимерных слоя.

Авторы наблюдали усиленное формирование и сохранение внутреннего и внешнего сегментов и продемонстрировали полезность этой платформы для тестирования на наркотики. Они продемонстрировали, что органоиды сетчатки экспрессируют маркеры основных клеток сетчатки, таких как: ганглиозные клетки, биполярные клетки, горизонтальные клетки, амакриновые клетки, глия Мюллера и фоторецепторы.

В целом, эта статья сильна с точки зрения биологической оценки, а также инженерных аспектов, связанных с изготовлением устройств.

Основные версии:

Рецензенты согласны с тем, что эта рукопись достаточно интересна и нова, чтобы оправдать ее дальнейшее рассмотрение в eLife . Рецензенты также согласны с тем, что авторы должны показать важность перфузии в этой системе и продемонстрировать, чем она превосходит трансвелл, который мог бы стать важным элементом управления. Рецензенты согласны с тем, что этот вопрос следует решать экспериментально. Также необходимо провести статистический обзор с опытным статистиком.На остальные небольшие комментарии можно было бы ответить с помощью соответствующих пояснений со ссылками. Пожалуйста, ознакомьтесь с более подробными пояснениями к этим комментариям в обзорах ниже.

Конкретные точки:

Уточнение того, как долго вся структура стабильна, и есть ли дальнейшее ремоделирование структуры при длительном нахождении в культуре?

Фагоцитарная активность, описанная в статье, является неотъемлемым свойством RPE, и существуют коммерческие тесты для измерения этой функции в монокультуре RPE с использованием изолированных, флуоресцентно меченных POS.Воспроизведение этой функции в представленной модельной системе не полностью подтверждает утверждение о том, что РПЭ взаимодействуют с органоидами сетчатки.

Бесклеточный перфузионный канал, описанный в этой модели, совсем не представляет сосудистую сеть сетчатки, которая структурно и функционально интегрирована с другими типами клеток/тканей в сложной трехмерной среде для поддержания гомеостаза. Конфигурация системы может быть использована для имитации хориоидальных сосудов, но канал, используемый в этом исследовании, значительно отличается от хориокапилляров in vivo.

Одним из потенциальных преимуществ перфузии является поддержание паракринного градиента между органоидами сетчатки и эпителием. Но без трансвелл-контроля неясно, насколько значительна эта польза в этих экспериментах. Например, на рисунке 5H, где будут условия при совместном культивировании органоидов и эпителия в условиях трансвелла?

В разделе интенсивности флуоресценции авторы должны написать формулы в правильном формате.

Возможно, нужно изменить формулировку четвертого предложения в Резюме.

Рецензент №1:

В этой статье описывается разработка модели сетчатки глаза «орган-на-чипе». Бумага находится в авангарде органа на поле чипов. Сетчатку особенно сложно моделировать из-за большого количества различных типов клеток и сложной структурной организации. В этой статье описывается интеграция более семи различных типов клеток, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, в сосудистую систему, подобную перфузии.

Важно отметить, что авторы объединили органоиды с инженерией органов на чипе.Это представляет собой высокую степень новизны, поскольку это обычно не делается. Они объединили органоиды сетчатки, полученные из hiPSC, с клетками пигментного эпителия сетчатки, полученными из hiPSC, в устройстве сетчатки на чипе (RoC) на основе PDMS. Каждое устройство имело четыре идентичные микроткани, соединенные микроканалом, объединяющим два прозрачных и биосовместимых полимерных слоя.

Авторы наблюдали усиленное формирование и сохранение внутреннего и внешнего сегментов и продемонстрировали полезность этой платформы для тестирования на наркотики.Они продемонстрировали, что органоиды сетчатки экспрессируют маркеры основных клеток сетчатки, таких как: ганглиозные клетки, биполярные клетки, горизонтальные клетки, амакриновые клетки, глия Мюллера и фоторецепторы.

Я был бы признателен за разъяснение того, как долго вся структура стабильна, и есть ли дальнейшая реконструкция структуры при длительном нахождении в культуре?

Рецензент №2:

Это исследование интересно и важно тем, что оно впервые продемонстрировало включение органоидов, полученных из стволовых клеток, в культуру RPE для моделирования сетчатки, особенно фоторецепторных клеток, которые оказались сложными для рекапитуляции in vitro. Несмотря на этот положительный момент, основная масса данных, представленных в статье, носит весьма предварительный характер и не может обосновать основные утверждения авторов. Во-первых, одной из основных проблем является то, что эта система представлена как модель васкуляризированной сетчатки, что полностью вводит в заблуждение. Бесклеточный перфузионный канал, описанный в этой модели, совсем не представляет сосудистую сеть сетчатки, которая структурно и функционально интегрирована с другими типами клеток/тканей в сложной трехмерной среде для поддержания гомеостаза.Конфигурация системы может быть использована для имитации хориоидальных сосудов, но канал, используемый в этом исследовании, значительно отличается от хориокапилляров in vivo.

Еще одной серьезной проблемой является отсутствие данных, демонстрирующих функциональность и преимущества перфузионного канала. Во введении отсутствие васкуляризации в существующих модельных системах выделено как одна из основных проблем, побудивших это исследование, но представленные результаты не показывают, служит ли и каким образом структура каналов в нижнем слое для того, чтобы сделать эту модель превосходной и более физиологична. Нигде в рукописи нет контрольных данных, которые сравнивают результаты клеточной культуры при наличии или отсутствии потока. В связи с этим другой критический вопрос, который остается без ответа, заключается в том, действительно ли система на основе чипа необходима для этого исследования? Как отмечают авторы, модели MPS и орган-чип предлагают множество новых возможностей (например, точный контроль над растворимой микросредой и микросредой внеклеточного матрикса, встраивание и формирование пространственного паттерна различных типов клеток, контролируемая доставка и применение внешних факторов и т. д.) недостижимо в традиционных моделях in vitro. Весьма сомнительно, использует ли это исследование какие-либо из этих возможностей и имеет ли эта система преимущества перед обычными моделями in vitro на основе Transwell. Было бы легко установить аналогичную модель совместного культивирования во вкладышах Transwell и провести те же анализы.

Заявление о том, что эта модель является первой, которая повторяет взаимодействие между фоторецепторными клетками и ПЭС, также вызывает серьезные опасения. Фагоцитарная активность, описанная в статье, является неотъемлемым свойством RPE, и существуют коммерческие анализы для измерения этой функции в монокультуре RPE с использованием изолированных флуоресцентно меченных POS.Воспроизведение этой функции в представленной модельной системе не полностью подтверждает утверждение о том, что РПЭ взаимодействуют с органоидами сетчатки. Метод анализа, используемый в этом исследовании, также проблематичен, поскольку низкое разрешение изображения затрудняет интерпретацию данных. Понятно, что конфигурация устройства, особенно толщина нижнего слоя, создает проблемы для анализа изображений с высоким разрешением. Если это действительно так, то плохие данные изображения, по-видимому, предполагают ограничения этой модели на основе чипа.

Рецензент №3:

В рукописи Loskill et al. представлен Retinal-on-a-Chip, который сочетает органоиды сетчатки, полученные из hiPSC, состоящие из всех известных основных подтипов сетчатки, и монослой пигментного эпителия сетчатки в микрожидкостном устройстве на основе мембраны. В документе представлена характеристика как органоидов сетчатки, так и эпителия сетчатки. В комплексе исследование четко продемонстрировало функциональное нарушение пищеварения сегментных структур пигментным эпителием сетчатки, что является функциональным признаком зрительного цикла.Кроме того, авторы продемонстрировали фармацевтические испытания с противомалярийным препаратом и антибиотиком и указали, что условие совместного культивирования может играть защитную роль в фармацевтическом ответе. В целом, я думаю, что работа впечатляющая, новая и будет представлять большой интерес для сообщества. Данные хорошо представлены, а обсуждения очень обширны и сквозны. Меня беспокоит только полезность перфузии в существующей модели. Хотя эксперименты проводились на микрожидкостной платформе, кажется, что все эксперименты можно было бы провести и в стандартном трансвелле для достижения того же результата.Одним из потенциальных преимуществ перфузии является поддержание паракринного градиента между органоидами сетчатки и эпителием. Но без трансвелл-контроля неясно, насколько значительна эта польза в этих экспериментах. Например, на рисунке 5H, где будут условия при совместном культивировании органоидов и эпителия в условиях трансвелла? Я, безусловно, вижу потенциальную полезность этой модели, особенно за счет включения сосудистой системы и перфузии в будущем, о чем упомянули авторы.Учитывая потенциал этой платформы и представленные биологические данные, я думаю, что эта статья может быть принята к публикации.

https://doi.org/10.7554/eLife.46188.033

Органоид пищевода обещает использовать в исследованиях рака

Newswise — Роквилл, штат Мэриленд (1 декабря 2021 г.) — Исследователи из Сегедского университета в Венгрии впервые продемонстрировали, что органоид пищевода успешно дублирует жизненно важные функции этого органа. Исследование опубликовано в Американском журнале физиологии-клеточной физиологии .Он был выбран в качестве статьи APS select за ноябрь.

Органоиды представляют собой небольшие трехмерные тканевые конструкции, которые самоорганизуются в структуры, имитирующие функции определенного органа. Они выражают большую физиологическую сложность, чем традиционные клеточные культуры.

По данным Американского онкологического общества, примерно у 19 260 человек в США будет диагностирован рак пищевода в 2021 году. Хотя показатели пятилетней выживаемости улучшаются, уровень даже локализованного рака пищевода остается ниже 50%.Если к моменту постановки диагноза рак уже распространился на другие части тела, показатель снижается до 5%.

Органоид, изученный командой Сегеда, более полно воссоздает ионно-транспортные системы пищевода. Транспорт ионов в пищеводе важен для поддержания pH и для точного контроля того, способны ли и какие вещества преодолевать защитный клеточный барьер.

Ученые уже установили, что нарушение ионного транспорта играет роль в воспалительных и раковых заболеваниях пищевода.Подтвердив, что этот органоид моделирует перенос ионов, команда подтвердила, что это новый многообещающий «доклинический инструмент для оценки эффективности новых терапевтических соединений».

«Мы пришли к выводу, что [органоиды пищевода] представляют собой актуальную и подходящую модельную систему для изучения механизмов транспорта ионов эпителиальными клетками пищевода, и их также можно использовать в качестве доклинических инструментов для оценки эффективности новых терапевтических соединений», — пишут авторы. .

Прочтите статью полностью « Культура органоидов мышей является подходящей моделью для изучения пищеводных механизмов транспорта ионов », опубликованную в Американском журнале физиологии и клеточной физиологии .Он отмечен как один из «лучших из лучших» в этом месяце в рамках программы APS select Американского физиологического общества. Прочтите все избранных исследовательских статей этого месяца .

ПРИМЕЧАНИЕ ДЛЯ ЖУРНАЛИСТОВ: Чтобы записаться на интервью с членом исследовательской группы, позвоните в отдел по связям со СМИ APS или позвоните по телефону 301.

РубрикаРазное

Органоид осуществляющий транспорт веществ в клетке: 19 Одномембранный органоид , осуществляющий транспорт веществ , синтез жиров , углеводов и сложных белков

Сайт учителей биологии МБОУ Лицей № 2 города Воронежа

10кл РУС

Функции мембранных органелл клетки живого организма

Одномембранные органоиды

Двумембранные органоиды

Тема №12567 Ответы к тестам по биологии 9 тем 810 вопросов (Часть 1)

Проверочная работа 9 класс Строение клетки. 2 варианта. С ответами.

Abstract

Введение

Результаты

Влияние условий культивирования Органоидный клеточный состав и экспрессия переносчиков питательных веществ

Транспорт питательных веществ и лекарств в кишечных органоидах человека

Визуализация процессов транспорта пептидов в кишечнике

Анализ метаболитов в кишечных органоидах

Заключение

Трехмерные органоиды, полученные из тонкой кишки: новый инструмент для исследования транспорта лекарств

Abstract

Ключевые слова

Сокращения

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Органоиды: новый взгляд на болезни, разработки и открытия

Ученые нашли способы культивирования органоспецифической ткани из стволовых клеток, которые могут изменить подход к изучению и лечению заболеваний.

Понимание себя и моделирование болезни

Изучение болезней стволовых клеток и персонализированная медицина

Органоиды как терапевтические инструменты

Революция в открытии лекарств

Стандартизированное масштабируемое производство органоидов поджелудочной железы человека в соответствии с GMP | Исследования и терапия стволовых клеток

Ткань поджелудочной железы взрослого человека

Выделение и культивирование органоидов поджелудочной железы

Криоконсервация

Кривая роста in vitro

Анализ кариотипа

Измерение диаметра и площади

Измерение потребления глюкозы и продукции лактата в культурах hPO

Проточная цитометрия

Экстракция и анализ РНК

Иммунофлуоресцентный анализ

Статистический анализ

Транспортировка при комнатной температуре не влияет на биологическую активность органоидов сетчатки, полученных из плюрипотентных стволовых клеток

Abstract

1. Введение

2. Материалы и методы

2.1. Культура плюрипотентных стволовых клеток

2.2. Дифференцировка иПСК человека в органоиды сетчатки

2.3. Срезы органоидов

2.4. Иммуногистохимия (ИГХ)

2.4.1 Окрашивание TUNEL.

2.5. RT и отправка органоидов сетчатки

2.6. Микроскопия

2.6.1. Количественная оценка изображения.

2.7. Электрофизиологические записи

2.8. Трансмиссионная электронная микроскопия (ПЭМ)

2.9. Статистический анализ

3. Результаты

3.1. Кратковременное хранение органоидов сетчатки на 360-й день при комнатной температуре не вызывает фенотипических или структурных различий

3.2. Транспортировка органоидов в условиях КТ

3.2.1. Сравнение контрольных и отправленных органоидов на 135-й день.

3.2.2. Сравнение контрольных и доставленных органоидов на 160-й день.

4. Обсуждение

Вспомогательная информация

S4 Рис. Иммуногистохимический анализ маркеров сетчатки контрольных и отправленных органоидов сетчатки на 135-й день, показанных на фиг. 3, в разделенных каналах.

S5 Рис. Иммуногистохимический анализ маркеров сетчатки контрольных и отправленных органоидов сетчатки на 160-й день, показанных на фиг.

Благодарности

Каталожные номера

Объединение технологий органоидов и органов на чипе для создания сложных многослойных моделей тканей на платформе сетчатки глаза человека на чипе

Органоид пищевода обещает использовать в исследованиях рака

Добавить комментарий Отменить ответ