Не имеют постоянной формы клетки кишечной палочки: Не имеют постоянной формы клетки: а) кишечной палочки б) эвглены зелёной в) фибропласты

Содержание

Белки иммунной системы человека оказались эффективными для лечения хламидиоза — Наука

Хламидии — бактерии-паразиты, возбудители хламидиоза. Ежегодно в мире хламидиозом заражаются более 90 миллионов человек. Заболевание передается в основном половым путем и выражается в воспалении органов мочеполовой системы.

Хламидии существуют в форме элементарных и ретикулярных телец. Элементарные тельца хорошо защищены и приспособлены к выживанию в межклеточном пространстве. Это позволяет им распространяться в организме и заражать другие клетки. Ретикулярные тельца не имеют постоянной формы и размера и существуют только внутри клетки-хозяина. В этой форме у хламидий запускается обмен веществ и они размножаются. Такой сложный жизненный цикл позволяет хламидиям избегать действия большинства антибактериальных белков.

Пептидогликан — один из компонентов клеточной стенки некоторых бактерий. Белки иммунной системы человека, которые его распознают, играют важную роль в борьбе с инфекциями. Они могут присоединяться к бактериям и ломать систему внутриклеточного обмена веществ, что приводит к гибели микроорганизма.

Ранее уже было показано, что пептидогликан-распознающие белки могут уничтожать бактерии кишечной (Escherichia coli) и сенной (Bacillus subtilis) палочек, чья система реакции на враждебные условия внешней среды аналогична системе хламидий вида Chlamydia trachomatis. Поэтому исследователи решили посмотреть, могут ли пептидогликан-распознающие белки замедлять распространение хламидий.

В культуру человеческих клеток ученые добавили растворы, содержащие белки, а затем заразили ее хламидиями вида Chlamydia trachomatis и через 48 часов оценили количество микроорганизмов. Оказалось, что пептидогликан-распознающие белки подавляют рост хламидий: в образцах с ними было в 10 раз меньше бактерий, чем в контрольных.

Число хламидий, внедрившихся в другие клетки, в культурах клеток с тремя видами пептидогликан-распознающих белков и в контрольном образце через 48 часов после заражения. Иллюстрация пресс-службы МФТИ

Также ученые оценили изменение уровня экспрессии генов хламидии со временем. Оказалось, что в контрольном образце она оставалась неизменной, тогда как в образцах с белком для генов, связанных с реакцией на враждебные условия внешней среды, наблюдалось два характерных пика — через час и через 72 часа после заражения. В это время бактерии находились в форме элементарных телец, и поэтому ученые предположили повышенную уязвимость к пептидогликан-распознающим белкам именно на этой стадии жизненного цикла бактерий.

Уровни экспрессии двух генов (ctcB и ctcC), связанных с реакцией на враждебные условия внешней среды, в присутствии трех видов исследуемых белков и в контрольном образце для пяти разных моментов времени. Иллюстрация пресс-службы МФТИ

Исследование принято к публикации в журнале

Infection and Immunity. По словам ученых, его результаты будут полезны для разработки новых лекарств от хламидиоза.

Хламидии могут отвечать и за развитие других заболеваний. Так, международная группа ученых во главе с профессором Рутом Итзаки из Оксфорда видит их след в болезни Альцгеймера.

Воспалительные заболевания женских половых органов

Проблема воспалительных гинекологических заболеваний занимает важное место в деятельности врача акушера-гинеколога.

Эти заболевания у гинекологических больных встречаются значительно чаще других заболеваний половых органов.

Значение воспалительных заболеваний особенно велико, так как известно, что они часто обостряются, приводя больных к нетрудоспособности и даже инвалидизации. Кроме того, воспалительные процессы половых органов нередко ведут к нарушениям менструальной функции, вызывают бесплодие, общую интоксикацию организма с вовлечением в патологический процесс нервной системы, печени, почек и других жизненно важных органов и систем.

Причиной развития воспалительных заболеваний женских половых органов обычно являются микробные или вирусные возбудители.

Пути проникновения микробов в гениталии:

  1. Половой – активный транспорт микробов из влагалища в вышележащие органы реализуется сперматозоидами и трихомонадами. Сперматозоиды обладают отрицательным зарядом, который является своеобразным рецептором для микробов.
  2. Пассивный транспорт (самостоятельное распространение микробов и вирусов по половым органам).
  3. Гематогенный транспорт (из других органов с током крови).
  4. Лимфогенные (по лимфатической системе), например, из кишечника при гнойном аппендиците.

Факторы, способствующие распространению инфекции (провоцирующие факторы):

  1. Переохлаждение, ослабление общих защитных сил организма в результате заболеваний других органов и систем.
  2. Физиологическое (менструация, роды) или искусственное (аборт, внутриматочные спирали, внутриматочные диагностические и лечебные вмешательства, операции на органах брюшной полости, ЭКО и др.) ослабление или повреждение защитных (барьерных) механизмов шейки матки.
  3. Социальные факторы: хронические стрессовые ситуации, низкий уровень жизни (недостаточное и нерациональное питание, неблагоприятные условия жизни), хронический алкоголизм и наркомания.
  4. Поведенческие факторы: раннее начало половой жизни, высокая частота половых контактов, большое количество и частая смена половых партнеров при этом – использование гормональной, а не барьерной контрацепции, нетрадиционные формы половых контактов (орогенитальный, анальный), половые отношения во время менструации, частые спринцевания и самолечение, неправильное использование внутривлагалищных тампонов и др.

Начало заболевания часто связано со сменой полового партнера.

Специалисты классифицируют воспалительные заболевания женских половых органов по вызвавшим их возбудителям, по месту локализации, по давности и выраженности симптомов.

По виду возбудителя заболевания в гинекологии могут быть специфическими и неспецифическими:

  1. Специфические воспаления вызваны инфекциями, передающимися половым путем. К ним относят ВИЧ, гонорею, герпес, трихомониаз, гонококк, трихомонаду, хламидиоз и другие. Иногда в качестве возбудителей могут выступать сразу несколько инфекций.
  2. Неспецифические воспаления вызваны собственной флорой женщины, которая активизируется, если в организме произошли сбои: кишечной палочкой, стрептококком, стафилококком и др. В последние несколько лет все больше проблем доставляют женщинам вирусы и простейшие грибы, которые в обычном состоянии являются частью нормальной микрофлоры влагалища.

Как таковой разницы между специфическими и неспецифическими заболеваниями нет, зато есть общее правило —приступить к лечению сразу после появление первых симптомов.

По характеру воспаления могут быть острыми, подострыми, хроническими и обостренными:

  1. Острое течение процесса возникает впервые и сопровождается яркими клиническими проявлениями.
  2. Подострое также беспокоит женщину в первый раз, однако выражено не так явно.
  3. Хроническое течение длится более четырех недель. Жалобы от пациентки на протяжении этого времени, как правило, отсутствуют и появляются лишь при обострении хронического процесса. Жалобы могут быть связаны и с уже наступившими осложнениями хронического процесса (нарушение менструальной функции, бесплодие, нарушение функции других органов и систем).

Течение воспалительного процесса зависит от характера возбудителя и особенностей защитных сил организма женщин. При срыве защитных сил организма может произойти распространение процесса (сепсис).

По месту поражения женские заболевания делятся на два типа — поражения верхнего и нижнего отделов гениталий.

  1. Поражения верхнего отдела объединяют следующие болезни: сальпингоофорит (воспаление яичников и маточных труб), эндометрит (воспаление слизистой оболочки тела матки), пельвиоперитонит (воспаление брюшины), параметрит (воспаление околоматочной клетчатки), тубоовариальный абсцесс (гнойное воспаление придатков матки).

    Самым распространенным воспалительным заболеванием у женщин является сальпингоофорит.

    Симптомы:

    Чаще всего острый, гнойный сальпингоофорит начинается остро:

    1. Повышение температуры, иногда сопровождающееся ознобами. Размахи температуры могут быть различны, характерно вечернее повышение температуры при нормальных или субфебрильных показателях утром.
    2. Боли в низу живота. Возникают остро. В начале заболевания они, как правило, носят локальный характер, и пациентка может четко указать область поражения, при наличии сопутствующего воспаления матки и окружающих тканей боли могут быть распространенными и иррадиировать в поясницу, прямую кишку и бедро).
    3. Обильные гнойные (реже – серозо-гнойные) бели и резей при мочеиспускании. Как правило, они сопровождаются гнойными выделениями из уретры, что приводит также к появлению у больных частого, малыми порциями, болезненного мочеиспускания или сильных резей при мочеиспускании.
    4. В последующем присоединяются симптомы гнойной интоксикации (слабость, тахикардия, мышечные боли, чувство сухости во рту), диспепсические и эмоционально-невротические и функциональные расстройства.

    Полного излечения, как правило не происходит, чаще заболевание приобретает хроническое течение с периодическими обострениями.

    Обострение хронического сальпингоофорита может начаться под влиянием многих внешних факторов: переохлаждения, перегревания, утомления, реже связано с реинфекцией. В период обострения повышается температура, появляются или усиливаются боли в низу живота, увеличивается количество выделений. Обычно боли усиливаются перед и во время менструаций, иногда нарушается цикл. До половины больных отмечают нарушения половой функции: исчезает либидо, коитус становится болезненным. При продолжительном течении и частых рецидивах в патологический процесс вовлекаются мочевыделительная, нервная, эндокринная, сосудистая система, и заболевание приобретает характер полисистемного процесса.

    Эндометрит

    Симптомы:

    Острая форма заболевания обычно развивается после перенесенных лечебно-диагностических вмешательств на матке, операций. Предрасполагающими факторами являются оставление в полости матки плодных оболочек во время аборта, сгустков крови, большое количество патогенных и условно-патогеных (эшерехий, протей и др.

    ) микроорганизмов во влагалищном биоценозе.

    Острая форма начинается с повышения температуры тела появляются боли в низу живота, выделения из половых путей различного характера (гнойные, кровянисто-гнойные), женщины жалуются на слабость, головную боль.

    Без лечения воспаление может распространиться на все слои матки и параметрий – клетчатку, расположенную между листками широких связок матки. Развивается параметрит. Острая форма параметрита может привести к абсцессу параметрия, который иногда самостоятельно вскрывается в прямую кишку, матку, брюшную полость или мочевой пузырь.

    При неадекватном лечении развитие переходит в хроническое.

    Хронический эндометрит характеризуется светлыми серозными выделениями из половых путей, периодическими маточными кровотечениями вне менструации. Иногда хронический процесс протекает без каких-либо внешних симптомов, но приводит при этом к нарушению менструального цикла, невынашиванию, бесплодию.

    Пельвиоперитонит – воспаление брюшины малого таза. Чаще является осложнением вышеперечисленных заболеваний.

    Симптомы: заболевание характеризуется острыми болями в животе, тошнотой, рвотой, вздутием живота, задержкой стула и газов, повышением температуры, учащением пульса. Язык сухой, обложен белым налетом. При современном (стертом) течении возможна малая выраженность симптомов или отсутствие некоторых из них.

    Больные нуждаются в особом наблюдении в связи с возможностью перехода пельвиоперитонита в разлитой перитонит, при котором необходима экстренная операция.

  2. К поражениям нижнего отдела относится вульвит, кольпит (вагинит), уретрит, бартолинит и цервицит (экзоцервицит, эндоцервицит).

    Вульвит — воспаление слизистой оболочки преддверия влагалища. Развивается в основном у девочек. Инфицированию способствуют опрелости, расчесы, ссадины, эндокринная патология (ИЗСД), глистные инвазии, детские вирусные инфекции. У взрослых, как правило, вульвит сочетается с воспалением слизистой влагалища.

    Клиника: боль, отек вульвы, гнойное отделяемое.

    Бартолинит — это воспаление больших желез преддверия влагалища. Очень часто при несоблюдении правил гигиены половых органов в нее попадают различные бактерии и ИППП. Ее выводной проток закупоривается и в железе возникает воспалительный процесс. Чаще встречается одностороннее поражение бартолиновой железы.

    Проявляется сначала покраснением вокруг наружного отверстия выводного протока, далее воспалительный отек может закупоривать проток железы, препятствуя выделению гнойного секрета, который, задерживаясь в протоке, растягивает его, образуя ложный абсцесс (гнойник), который выпячивает внутреннюю поверхность большой половой губы и закрывает вход во влагалище. Может повышаться температура тела, болезненность в области промежности. В редких случаях воспалительный процесс может захватывать непосредственно ткань железы, при этом возникает истинный абсцесс с сильным нагноением и увеличением железы. Припухает большая и малая половые губы. Увеличиваются паховые лимфатические узлы. Повышается температура тела. От ложного абсцесса истинный отличается постоянной болью, резкой отечностью половой губы, неподвижностью кожи над абсцессом, высокой температурой.

    Гнойник может самопроизвольно вскрываться с истечением густого желто-зеленого содержимого, после чего состояние улучшается. Воспалительный процесс может затухать самостоятельно (без нагноения). При этом наблюдается уплотнение и незначительное увеличение железы. Однако довольно часто через некоторое время воспалительный процесс возобновляется и осложняется.

    Кольпит — воспаление влагалища (вагинит).

    В клинической картине триада симптомов: боли, бели, зуд.

    Кольпит могут вызывать гонококки, трихомонады, хламидии, а также условно патогенные микроорганизмы, такие как стафилококки, стрептококки, грибы рода Candida, кишечная палочка и др. Выделяют острый и постоянный вагиниты. При остром процессе женщины жалуются на зуд в области преддверия влагалища, жжение, ощущение давления, жара в половых органах и малом тазу, многие отмечают дизурические растройства. Характерным являются обильные выделения – бели. Воспалительный процесс, вызванный различными возбудителями, имеет свои особенности. Например, обильные пенистые желтовато-зеленые выделения с неприятным запахом характерны для трихомонадного вагинита; выделения белого творожистого вида – для грибкового. При хронических формах воспаления боли отсутствуют, в основном больные жалуются на выделения, зуд, жжение, небольшие изъязвления в области преддверия влагалища.

    Бактериальный вагиноз (диагноз с 1980 года) болезнь Гарднера. Жалобы только на повышенное отхождение белей (выделения обильные, дурно пахнущие). Симптомов воспаления нет. Часто женщины жалуются на дискомфорт и жжение во влагалище. В последнее время бактериальный вагиноз рассматривают как своеобразный дизбактериоз влагалища, возникающий при уменьшении числа лактобактерий, выделяющих молочную кислоту, повышении рН вагинального секрета (больше 4,5). При этом создаются условия для массивного размножения таких микроорганизмов, как гарднереллы и облигатные анаэробы бактерии. Это заболевание редко встречается у девочек в препубертатном периоде и у женщин в постменапаузе, что указывает на большое значение гормонального компонента в возникновении такого дисбаланса.

    Цервицит представляет собой воспаление шейки матки, которое возникает в результате проникновения в цервикальный канал гонококков, трихомонад, хламидий, стафилококков, стрептококков и других бактерий, реже вирусов. Возникновению способствуют разрывы шейки матки при родах, опущение половых органов, инфекционные процессы во влагалище и, наоборот, во внутренних половых органах. При остром процессе женщину беспокоят слабые боли в низу живота, неприятные ощущения во влагалище, иногда зуд, слизистые или гнойно слизистые выделения из влагалища, болезненные ощущения во время половых контактов. При хроническом процессе жалобы выражены слабее.

    Эндоцервицит – воспаление слизистой оболочки канала шейки матки. Может возникать при проникновении различных бактерий (стафилококков, стрептококков, гонококков, кишечной эшерихии и др. ). Эндоцервицит часто сочетается с воспалительным процессом в других отделах полового аппарата – кольпитом, сальпингоофоритом, эрозией шейки матки.

    Симптомы: слизисто-гнойные выделения из влагалища, болевых ощущений нет. Клинические признаки выражены мало. В острой стадии определяется гиперемия вокруг наружного зева и слизисто-гнойные выделения. В хронической стадии гиперемии почти нет, выделения остаются. При длительном течении процесса развивается гипертрофия (утолщение) шейки матки – цервицит

    Кондиломы остроконечные (множественные разрастания по поверхности наружных половых органов и входа влагалища). Могут распространяться на промежность, влагалище, шейку матки. Причиной возникновения кондилом служит фильтрующийся вирус (вирус папилломы человека), развитию процесса способствуют обильные выделения из половых путей при кольпитах и эндоцервицитах. Очень быстро остроконечные кондиломы разрастаются при беременности.

    Симптомы: кондиломы чаще всего локализуются на наружных половых органах, промежности, вокруг заднепроходного отверстия. В случаях некроза кондилом и присоединения вторичной инфекции появляется гнойное отделяемое. Кондиломы влагалища и шейки матки во время беременности и родов могут быть причиной кровотечения. Диагноз ставят на основании осмотра.

Программа обследования при воспалительных заболеваниях органов малого таза (ВЗОТ)

Наименование обследования

Информация, которую может давать обследование

Общий анализ крови

Лейкоцитоз, палочкоядерный сдвиг влево, ускорение СОЭ, лимфопения при острых и 1 м варианте обострения хронических ВЗОТ

СРВ, серомукоиды

Увеличение уровня при острых и 1-м варианте обострения хронических ВЗОТ

Общий белок, белковые фракции

Снижение уровня общего белка, альбуминов, повышение содержания глобулинов при острых и 1-м варианте обострения хронических ВЗОТ

Средние молекулы, среднемо-лекулярные пептиды для оценки эндогенной интоксикации

Увеличение уровня (норма: средние молекулы -56,8±1,3 ед/мл; среднемолекулярные пептиды -85,4±1,8 мкг/мл) при острых и 1-м варианте обострения хронических ВЗОТ

УЗИ органов малого таза

Информативно в сочетании с анамнестическими, клиническими и клинико-лабораторными данными в диагностике серозных и гнойных ТОВО, абсцессов малого таза, патологических изменениях: структуре яичников, спаечного процесса, инфильтративных изменений в органах и тканях малого таза, при оценке результатов консервативного лечения в динамике

Иммунограмма

При остром и обострении хронического процесса: рост абсолютного и относительного числа нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови, а также их функциональной активности в НСТ-тесте при низком функциональном резерве; снижение показателей фагоцитоза; повышение ИЛ-1 – продуцирующей активности моноцитов; повышение содержания лизоцима в сыворотке крови; повышение уровня IgM и IgG в периферической крови; снижение количества и функциональной активности лимфоцитов периферической крови; возрастание значение соотношения Т4Л8 (хелперы/супрессоры).
При хроническом процессе вне обострения: снижение количественных и функциональных показателей клеточных элементов системы мононуклеарных фагоцитов; вторичный иммунодефицит по системе Т- и В-клеточного иммунитета; понижение уровня IgA, повышение количества IgM и IgG; повышение уровня ЦИК.

Первичная микроскопия нативного материала из влагалища, цервикального канала, полости матки, малого таза (пунктат), маточной трубы (лапароскопия)

Ключевые клетки, трихомонады, грибковая флора, лейкоцитоз.

Мазок, окрашенный по Граму из влагалища, цервикального канала, полости матки, малого таза (пунктат), маточной трубы (лапароскопия)

Диагностика гонореи, трихомониаза, бактериального вагиноза, кандидоза; лейкоцитоз, степень функциональной активности лейкоцитов. Оценка степени обсемененности материала раздельно для грамм-отрицательных и грамм-положительных палочек, грамм-положительных кокков, грибов с использованием следующих критериев: в большом количестве – более 100 микроорганизмов в поле зрения; в умеренном количестве – 20-100 микроорганизмов в поле зрения; в малом количестве – 5-20 микроорганизмов в поле зрения; микрофлора не определяется. Для определения инвазивности (агрессивности) грибковой микрофлоры отмечается наличие почкующихся дрожжевых клеток, элементов мицелия и псевдомицелия. Результат получают в течение 1 часа.

Посев на аэробную и анаэробную микрофлору, определение чувствительности к антибиотикам содержимого влагалища, цервикального канала, полости матки, маточных труб и малого таза

Определение характера биоценоза влагалища, выявление этиологически значимых аэробных и анаэробных микроорганизмов и их антибиотикочувствительности.

Определение возбудителя методом ПЦР или количественными методами (бак. посев, Фемофлор) в мазках-соскобах из цервикального канала, эндометрия, маточных труб, малого таза (хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, вирусы)

Подтверждение диагноза хламидиоза, микоплазмоза, уреаплазмоза, вирусной инфекции гениталий. Результат получают в течение 1 суток.

Аспирационная биопсия эндометрия

Оценка функциональных возможностей яичников и рецепции эндометрия по гистологическим изменениям слизистой оболочки матки, диагностика характера воспалительного процесса в эндометрии, гистобактериоскопическая характеристика возбудителя, получение представлений о состоянии местного иммунитета (иммуноморфологические реакции) и протективных возможностей слизеобразующего аппарата матки (лектиногистохимические исследования).

Гистероскопия

Проводится при хронических ВЗОТ для: выявления наиболее измененных участков эндометрия; проведение прицельной биопсии эндометрия для гистологического, гистохимического исследования и определения возбудителя; обнаружение сопутствующей патологии.

Лапароскопия – «золотой» стандарт диагностики острых ВЗОТ

Установление характера воспаления, степени изменений маточных труб, наличия осложненных ВЗОТ. Дифференциальная диагностика. Биопсия материала для бактериологических и гистологических (иммуноморфологических, лектиногистохимических) исследований. Лечебные мероприятия.

Лечение воспалительных заболеваний женских половых органов

Важно помнить!!!

Выбирать метод лечения самостоятельно, основываясь на опыте подруг, родственников или на информации в СМИ, литературе – серьезная ошибка. Только обращение к врачу акушеру-гинекологу сразу при появлении первых симптомов поможет избежать серьезных осложнений и перехода воспалительного процесса в хронический. Так как двух одинаковых людей не бывает, схема лечения всегда назначается индивидуально с учетом особенностей организма, показателей обследования, наличия у женщины заболеваний других органов и т.д. При этом врач обращает внимание на возможные аллергические реакции, состояние иммунитета.

Также не стоит забывать, что хронические заболевания очень трудно поддаются лечению и избавиться от них можно только с помощью высококвалифицированного специалиста. В противном случае неизбежны рецидивы и осложнения, которые нередко опаснее самой болезни.

Хронические гинекологические заболевания нередко являются первопричиной нестабильного эмоционального состояния и снижения качества сексуальной жизни. Стоит помнить и о реальной опасности дисфункции репродуктивной системы, то есть — невозможности зачать и родить ребенка. Какими бы ни были последствия болезней, они всегда меняют жизнь женщины к худшему.

Общими принципами успешного лечения являются:

  1. Своевременная и точная диагностика, в том числе контрольная после курса лечения
  2. Своевременное начало лечения
  3. Индивидуальный, комплексный и грамотный подход
  4. Одновременное лечение половых партнеров
  5. Соблюдение диеты во время лечения
  6. Профилактика осложнений и обострений

!!!!Лечение воспалительных заболеваний женских половых органов должно быть комплексным, то есть воздействовать на все механизмы развития заболевания!!!!

Итак, в арсенале врачей гинекологов следующие методы лечения:

  1. При острых воспалениях, обострении хронических назначаются антибактериальные противовирусные препараты, которые призваны бороться с возбудителем.
  2. Параллельно проводится коррекция иммунных нарушений.
  3. Чтобы снизить реакцию организма на разрушение микробов, проводят десенсибилизирующую терапию.
  4. Для удаления из организма токсических веществ назначают дезинтоксикационную терапию
  5. При необходимости, во время курса лечения назначают лечение сопутствующих жалоб и симптомов (например, препараты против зуда, боли и др.)
  6. Для профилактики отрицательного воздействия лекарств на другие органы, а также для того, чтобы назначаемые препараты “работали” с более полной отдачей назначают ферментные препараты, пробиотики.*
    *Препараты для вышеперечисленных методов могут быть назначены как в таблетированном виде для приема внутрь, так и в виде различных инъекций. Инъекции препаратов необходимо проводить в медицинском учреждении под контролем медицинского персонала (обычно – в условиях процедурного кабинета)
  7. Местное лечение (спринцевания, ванночки, тампоны с лекарственными средствами, обработки, аппликации, орошения и др. ) используются для усиления эффекта антибактериальной и противовирусной терапии, а также как самостоятельный вид лечения при некоторых заболеваниях. Проводится в условиях процедурного кабинета или в домашних условиях. Для местного лечения используются различные лекарственные средства, действие которых направлено на борьбу с возбудителем, снятие симптомов воспаления, удаление продуктов распада микробов и т.д.
  8. Фитотерапия – лечение растительными препаратами. Может использоваться в комплексе с другими методами и самостоятельно. Как для общего лечения, так и для местного.
  9. Немедикаментозное лечение объединяет большое количество методов:
    1. Хирургическое (обычно применяется при неэффективности консервативного лечения или для удаления патологических образований в “холодный период”, то есть, после стихания острого воспаления). Проводится в условиях стационара.
    2. Акупунктура – воздействие на биологически активные точки (мезотерапия, электростимуляция активных точек, пальцевой массаж, иглорефлексотерапия)
    3. Лечебная физкультура
    4. Диетическое питание
    5. Санаторно-курортное лечение
    6. Физиотерапия – это один из методов лечения, в котором используются не химические факторы (лекарства), а физические: токи, магнитные поля, лазер, ультразвук и др.

Физиотерапия (в гинекологии в частности) в медицине и как и лекарственная терапия, подбирается индивидуально в зависимости от многих-многих особенностей человека и его болезни. Физиотерапия хороша тем, что она помогает и дополняет лечение состояний, которые не всегда хорошо поддаются традиционной терапии.

Применение физических факторов традиционно является важной составляющей в профилактике и лечении акушерской и гинекологической патологии. Физические факторы могут быть основным или вспомогательным методом в комплексе лечебных мероприятий. Особенно актуальна физиотерапия при долечивании острых воспалительных процессов и при лечении хронических. Например, при ряде хронических заболеваний женской половой сферы приток крови к органам малого таза может быть затруднён в связи с изменениями тканей и сосудов. Медикаментозное воздействие в этом случае малоэффективно, так как действующее вещество с током крови не поступает в должном объёме к органу или ткани, оказывая при этом общее, часто негативное влияние на организм женщины в целом. Сочетание же лекарства с физиотерапией, комплексный подход к лечению заболевания позволяет добиться улучшения состояния и качества жизни женщины при минимальной лекарственной нагрузке.

При некоторых болезнях физиотерапия часто является единственным методом лечения. Например, хроническая тазовая боль как следствие спаечного процесса и невралгия тазовых нервов после перенесенных воспалительных заболеваний, оперативных вмешательств изматывают пациенток физически и морально, нарушая нормальный образ жизни и гармонию сексуальных отношений. Проведенное физиотерапевтическое лечение способствует не только сокращению протяженности периода выздоровления, но и препятствует образованию спаек. Последний факт особенно значим для женщин с бесплодием. Таким образом, при проведении физиотерапевтического лечения наблюдается целый ряд положительных эффектов:

  • сокращение сроков лечения
  • мягкие безболезненные лечебные эффекты
  • профилактика осложнений и рецидивов
  • отсутствие побочных эффектов, свойственных медикаментозному лечению
  • снижение лекарственной нагрузки или, в некоторых случаях, отказ от них

Наиболее часто используются сегодня в гинекологии следующие аппаратные физические факторы:

  • Электрическое и магнитное поля. Действующим фактором электромагнитного поля может быть преимущественно его электрическая или магнитная составляющая. Магнитотерапия характеризуется, в основном, противовоспалительным эффектом, который связан противоотёчным действием фактора. Это позволяет широко использовать магнитное поле в гинекологии в раннем послеоперационном периоде после хирургических вмешательств.
  • Электротерапия (использование электрического тока). Возможно использование постоянного тока (гальванизация, лекарственный электрофорез), импульсных токов (интерференцтерапия, электростимуляция и др.). Лечение импульсными токами снимает спазм сосудов и гладкой мускулатуры, что способствует улучшению кровоснабжения тканей, оказывает обезболивающий эффект.
  • Действие факторов механической природы (ультразвуковая терапия). Ультразвуковые (УЗ) воздействия осуществляют своеобразный микромассаж клеток и тканей, сопровождающийся появлением тепла, и обеспечивают обезболивающий эффект, «размягчение спаек», улучшения кровоснабжения тканей и повышают гормональную активность яичников.
  • Фототерапия. Лечение светом – использование ультрафиолетовых (УФ-лучи), инфракрасных и видимых лучей. Коротковолновые УФ-лучи, например, при прямом попадании на патогенные микроорганизмы, находящиеся непосредственно на коже или слизистой оболочке, вызывают выраженный бактерицидный эффект и применяются в лечении воспаления слизистой наружных половых органов и влагалища. К фототерапии относится и применение лазерного излучения. Низкоинтенсивное лазерное излучение включают в комплекс лечения эндоцервицитов (воспаления канала шейки матки), кольпитов (воспаление слизистой влагалища) и воспалительных заболеваний органов малого таза.

При воспалительных заболеваниях женской половой сферы чаще используются следующие физические воздействия:

  1. Индуктотерапия
  2. УВЧ
  3. Электрофорез лекарственных средств, фонофорез
  4. Ультразвук
  5. Импульсные токи низкой частоты
  6. Парафинотерапия
  7. Грязелечение
  8. Озокерит
  9. Бальнеотерапия

Используются также и нетрадиционные методы лечения, такие, как гирудотерапия (лечение пиявками), апитерапия (лечение пчелами и продуктами пчеловодства).

Профилактика воспалительных заболеваний у женщин

Кто предупрежден, тот вооружен, поэтому специалисты настоятельно рекомендуют девушкам и женщинам соблюдать ряд простых правил, которые помогут избежать возникновения серьезных проблем со здоровьем.

  1. Употребляйте как можно больше цитрусовых и бобовых, блюд из рыбы и картофеля, а также кисломолочных продуктов (особенно тех, в чей состав входят бифидобактерии). Это позволит избежать дисбактериозов наружных половых органов.
  2. Во время менструации используйте при необходимости – днем тампоны, а ночью прокладки. Помните, что супервпитывающие тампоны, а также тампоны, остающиеся во влагалище на шесть и более часов, способствуют размножению микроорганизмов.
  3. Не приобретайте специфические средства интимной гигиены: цветные тампоны и туалетную бумагу, мыло с отдушкой и спреи — это может стать причиной раздражения слизистой и развития дисбактериоза и воспаления.
  4. После бассейна или купания в море, старайтесь не ходить долго в мокром купальнике, так как это чревато опасностью переохлаждения органов малого таза и активизации в этих органах микробной и вирусной флоры. Кроме того, вы непроизвольно создаете идеальные парниковые условия для микробов.
  5. Отдавайте предпочтение белью из натуральных тканей — синтетические ткани почти не впитывают влагу и не обеспечивают достаточно хорошей циркуляции воздуха в области гениталий. Хлопковое белье не дает образоваться щелочной среде на слизистой влагалища.
  6. Ограничивайте в своем рационе продукты с высоким содержанием сахара. По мнению многих известных врачей, рафинированный сахар обладает свойствами, достаточными для поддержания хронического кандидоза.
  7. Обращайте внимание даже на незначительный дискомфорт при мочеиспускании — он может быть предвестником серьезного недомогания.
  8. Не ешьте слишком много хлеба и грибов, не злоупотребляйте алкоголем, особенно пивом — все эти продукты благоприятствуют возникновению хронических грибковых инфекций.
  9. Соблюдайте правила гигиены и пользуйтесь лишь своими бритвенными станками и другими туалетными принадлежностями.
  10. При гигиенических процедурах генитальной и перианальной области, ваши движения должны иметь направленность в сторону ануса, чтобы избежать занесения в половые органы кишечных болезней из анального отверстия.
  11. Если у вашего партнера обнаружилась какая-либо инфекция, вы также должны обратиться к гинекологу — с большой долей вероятности микробная флора будет беспокоить и вас.
  12. Избегайте случайных половых связей. Если же произошел незащищенный контакт со случайным половым партнером, необходимо как можно быстро обратиться в клинику для проведения профилактических мероприятий, предупреждающих заражением мочеполовыми инфекциями.

Какие проблемы решают биоинформатики в Сколтехе

March 28, 2018 3:37pm

Пять молодых ученых, научных сотрудников Центра системной биомедицины и биотехнологий Сколтеха, рассказали ТрВ-Наука о своих исследованиях и о том, можно ли сегодня заниматься наукой в России. Вопросы задавала Надежда Маркина. 

Как выключить жизнь и запустить обратно

Павел Мазин.

Павел Мазин, мл. науч. сотр., научная группа проф. Филиппа Хайтовича

— Павел, я знаю, что два объекта ваших последних исследований — это мозг и комар. Давайте начнем с мозга.

— ОК, хотя про комара, я думаю, статья получилась интереснее. Что касается мозга, то наша работа не столько про мозг, сколько про альтернативный сплайсинг. Два слова о том, что это такое. Информация о строении белков у эукариот закодирована в гене не непрерывно, а кусочками, экзонами; участки между ними — интроны — при копировании в РНК должны быть вырезаны. Этот процесс называется сплайсингом, и он может происходить по-разному — некоторые экзоны иногда пропускаются. Это и есть альтернативный сплайсинг.

— Это тот механизм, который позволяет одному гену кодировать несколько белков?

— Один из механизмов. Когда стали сравнивать сплайсинг у разных видов, выяснилось, что в мозге и печени человека он более сходен, чем в мозге человека и шимпанзе, хотя мозг и печень физиологически не имеют ничего общего. Это означает, что сплайсинг очень быстро эволюционирует, если даже между близкими видами он сильно различается. Но раз он не консервативен, значит, не несет большой смысловой нагрузки? Мы сравнили сплайсинг в коре больших полушарий у человека, шимпанзе и макаки от рождения и в разном возрасте. Конечно, надеялись увидеть какие-то специфические особенности человека, но оказалось, что изменения сплайсинга с возрастом у трех видов происходят примерно одинаково. И получается, что, несмотря на быструю в целом эволюцию сплайсинга, регулируемый альтернативный сплайсинг эволюционирует медленно.

— А что интересного вам рассказал комар?

— В этой работе получился совершенно неожиданный результат. Наш объект — это африканский комар, его личинка живет в лужах, которые пересыхают. Комар полностью высыхает, впадая в состояние, называемое «ангидробиоз» — буквально «жизнь без воды». А потом его можно размочить, и он совершенно нормально живет дальше. Выходит, можно в нем «выключить» жизнь и запустить обратно. Наши японские коллеги прочитали геном комара и нашли гены, которые начинают работать при высыхании. Анализируя эти данные, я искал ответ на вопрос, как активируются эти гены. И обнаружил, что у многих из них перед началом гена есть один и тот же мотив из семи нуклеотидов. Такой четкий сигнал — большая удача. Полагая, что это сайт связывания транскрипционного регулятора, мы стали искать этот регулятор, и мы его нашли! Им оказался регулятор теплового стресса. Это хорошо изученная и очень консервативная система. Но комар ее взял и приспособил для другой цели — при высыхании происходит не только тепловой стресс, но и много всего другого. Под регуляцию этого фактора попали сотни разных генов — это отличный пример пластичности регуляторных систем.

— Может ли из этого открытия появиться какой-то практический выход?

— Ну, выход на практику здесь как раз понятен. Было бы очень интересно научиться хранить «на полке», без заморозки, клеточные линии, ну а в перспективе — целые органы, хотя до этого, конечно, еще далеко.

— Павел, расскажите про вашу научную биографию.

— Я закончил ФББ МГУ, аспирантуру в МГУ, работал под руководством Михаила Гельфанда. С данными, полученными в группе Филиппа Хайтовича по альтернативному сплайсингу, я работал в Китае. А когда Филипп решил вернуться в Россию, он позвал меня в создаваемую лабораторию в Сколтехе, которая занимается исследованиями мозга. Сейчас мы немного сменили фокус работы на изучение липидного состава мозга. Для этого нужны масс-спектрометры, и они у нас есть.

— Работая здесь, ощущаете ли вы вовлеченность в мировое научное сообщество? Не думали уехать из России?

— Ну, только если для приобретения нового опыта, чтобы не работать всё время на одном месте. Но сейчас меня всё устраивает. А что касается вовлеченности, то это не зависит от места работы, для этого достаточно читать, публиковаться и ездить на конференции.

«Непонятный белок мы раскрутили в глобальный регулятор»

   

Мария Тутукина

Мария Тутукина, науч. сотр., научная группа проф. Михаила Гельфанда

— Мария, расскажите про ваши исследования в Сколтехе.

— Мы исследуем различные аспекты регуляции метаболизма бактерий, чтобы понять, как можно направленно модифицировать человеческий микробиом. Причем с помощью не антибиотиков, которые убивают как вредные, так и полезные бактерии, и не генной модификации, а определенных добавок. Хотим найти такие вещества, которые правильные бактерии будут с удовольствием есть и колонизовать кишечник и при этом не давать жить вредным бактериям. Это могут быть какие-то сахара или другие источники питания. Но для того, чтобы выбрать агент, нужно сначала понять, как бактерии утилизируют разные субстраты.

Одна из наших последних статей — о том, что у кишечной палочки одна и та же кассета генов может обеспечивать утилизацию сразу двух сахаров — лактозы и сульфоглюкозы. Сульфоглюкоза — очень экзотический сахар, у человека его нет, он встречается только у растений. Зачем кишечной палочке есть сульфоглюкозу, непонятно. Мы проанализировали кассету генов метаболизма сульфоглюкозы методами сравнительной геномики, и оказалось, что она очень похожа на кассету генов метаболизма лактозы. Потом это было подтверждено экспериментально. Отсюда следует вывод: кассета генов может быть многофункциональна, в зависимости от субстрата в питательной смеси переключаться на один или другой путь метаболизма. И, возможно, давая бактерии определенную добавку, мы можем этот путь задавать. В этой работе, которая делалась под руководством проф. Михаила Гельфанда, участвовали также школьники, теперь уже студенты. Они с помощью пипеток и пробирок помогали экспериментально проверять наши гипотезы: сами подбирали праймеры для изучения экспрессии генов, сами выделяли РНК.

— А как вы привлекали к работе школьников?

— Они занимались этой работой в рамках Школы молекулярной и теоретической биологии (molbioschool.com). Мы ее уже шесть лет делаем для старшеклассников, которые хотят попробовать себя в науке. Из Школы выросла и еще одна работа — про белок-регулятор, про который было известно только то, что он каким-то образом участвует в регуляции генов метаболизма сахаров. Но мы выяснили, что он влияет не только на метаболизм сахаров, но и на способности клеток кишечной палочки к подвижности, образованию колоний и формированию биопленок. И если мы будем направленно действовать на него, то сможем повлиять на способность бактерий прикрепляться к стенкам кишечника. Сейчас это большой проект, который мы делаем совместно с лабораторией Фёдора Кондрашова в IST Austria. Оказалось, что есть три формы этого белка, кодируемые одним геном, — они связываются с разными участками ДНК. Одна форма — с участками, которые регулируют метаболизм сахаров (а он важен для колонизации бактериями организма хозяина), другая — с участками, кодирующими ферменты и транспортеры метаболизма железа (это первое, что меняется при заражении). Сейчас мы пытаемся понять, как направленно модифицировать действие этого белка и таким образом менять что-то в микробиоме. Так маленький непонятный белок мы раскрутили в глобальный регулятор.

— Экспериментальной работой вы занимаетесь на базе Сколтеха?

— В сотрудничестве с Институтом биофизики клетки РАН. Но сейчас мы активно развиваем здесь экспериментальную базу. Очень хорошо, что у нас появился секвенатор одного из последних поколений Illumina, и теперь с помощью Марии Логачёвой мы можем быстро и хорошо отсеквенировать то, что нам нужно. Кроме того, мы уже больше восьми лет дружим с Бирмингемским университетом (Англия), в котором есть возможности работы с патогенными штаммами и подбора оптимальных лигандов направленного действия.

— Мария, какова ваша научная биография, которая привела вас в Сколтех?

— Я заканчивала биофак и химфак Воронежского университета, аспирантуру в Пущино, в Институте биофизики клетки.

— Была у вас возможность уехать из России?

— Да, она у меня и сейчас есть. Когда я заканчивала аспирантуру, было ощущение, что всё плохо, что науки в России нет. Но теперь, поработав в разных местах, я могу сказать, что и по креативности ученых, и по организации науки, и по атмосфере в хороших российских лабораториях не сильно хуже, чем во многих европейских странах.

— Ну, вероятно, Сколтех — это такой оазис, где можно молодым ученым работать в России, потому что их работа оплачивается на другом уровне, чем в институтах РАН?

— Конечно, работа с достойной зарплатой дает возможность думать о науке, а не о том, как выжить. Хотя деньги — это не главное.

«Мы ищем лаборатории и клиники, которые хотели бы с нами сотрудничать»

  

Елена Набиева.

Елена Набиева, науч. сотр., научная группа проф. Георгия Базыкина

— Елена, ваше исследование связано с медицинской проблематикой?

— Да, мы занимаемся исследованием спонтанного прерывания беременности у человека в тех случаях, которые не могут быть объяснены известными причинами. К известным причинам относятся, например, хромосомные аномалии. Некоторые трисомии (лишние хромосомы в кариотипе) совместимы с жизнью, такие как синдром Дауна, но бóльшая часть несовместима, так что значительная часть случаев прерывания беременности объясняется хромосомными аномалиями. Но нас интересуют другие генетические причины, возможно, какие-то точечные мутации, которые привели к потере беременности. Это могут быть неблагоприятные мутации, которые в рецессивном состоянии были у обоих родителей, но если они объединяются в геноме ребенка, такое сочетание может быть несовместимо с жизнью. Могут быть и более хитрые вещи, например, не мутации в каком-то одном гене, а просто слишком много вредных мутаций, или же у плода возникают новые мутации, которых не было у родителей.

— Вам уже удалось что-то понять?

— Этот проект находится на начальной стадии. Сейчас наша главная задача — собрать достаточное количество образцов. Мы сотрудничаем с лабораториями, которые занимаются анализом таких тканей, полученных из клиник. Работаем с теми случаями, где нет хромосомных аномалий и их нельзя объяснить методами, которые применяются в широкой практике. Мы эти образцы секвенируем, этим занимается наша коллега Мария Логачёва, причем нас интересует экзом — часть ДНК, кодирующая белки. При этом нам нужно секвенировать ДНК не только неродившихся детей, но и их родителей. Мы набрали некоторое количество таких «троек», и часть материала уже на стадии биоинформатического анализа, но нам нужно больше образцов.

— Есть ли подобные исследования в мире по такой жизненно важной проблеме?

— Насколько я знаю, подобных исследований в мире очень мало, а точно таких, как наше, не делалось вовсе. Были экзомные исследования, в которых имелась явная аномалия плода по УЗИ. Но если есть видимая патология, это сужает круг гипотез и список генов, которые надо изучить. Если же нет такой информации, то надо искать более широко. Так что наша задача более сложная.

— Вы исходно биоинформатик? Как вы оказались в Сколтехе?

— Я заканчивала Принстонский университет по специальности computer science, это даже не совсем биоинформатика, там больше алгоритмики. Я знакома с Георгием Базыкиным еще с аспирантуры, потом работала с ним в МГУ, и он пригласил меня в этот проект.

Надо сказать, что мы сейчас активно ищем лаборатории и клиники, которые хотели бы с нами сотрудничать. На сегодня мы работаем с тремя лабораториями, но хотели бы расширить их список.

О том, что бесполое размножение не всегда ведет к вымиранию

 

Ольга Вахрушева.

Ольга Вахрушева, мл. науч. сотр., научная группа проф. Георгия Базыкина

— Ольга, я знаю только то, что предмет вашего исследования — коловратки. Что это за звери?

— Я занимаюсь несколькими проектами, но давайте расскажу про бделлоидных коловраток. Это название подкласса (Bdelloidea), а вообще коловратки — это тип многоклеточных животных. Интересны бделлоидные коловратки в первую очередь тем, что, как считалось долгие годы, это одна из немногих древних групп видов, которые полностью отказались от полового размножения. Это важно в свете дискуссий о том, зачем вообще нужно половое размножение и почему оно получило такое широкое распространение среди эукариот. Одна из распространенных гипотез говорит о том, что оно позволяет более эффективно удалять из популяции вредные мутации. В доказательство этой гипотезы приводят тот факт, что группы бесполых организмов чаще всего сидят на концах веточек филогенетических деревьев и включают небольшое число видов. По-видимому, это означает, что переход к бесполому размножению приводит к быстрому вымиранию группы, и за то недолгое время, что эта бесполая группа существует, в ней не успевает возникнуть большое число видов. Но есть и контрпримеры, и один из самых ярких — бделлоидные коловратки. Считается, что они отказались от полового размножения несколько десятков миллионов лет назад, и за это время внутри этой группы появилось очень много видов. Никто не понимает, почему в этом случае переход к бесполому размножению не привел к вымиранию. Если бы было подтверждено, что бделлоидные коловратки размножаются исключительно бесполым путем, это был бы серьезный контраргумент против необходимости полового размножения для долгосрочного успеха вида.

— Где они живут?

— Это микроскопические беспозвоночные, которые живут в воде, во мху или в почве, где много воды. Ученые просмотрели несколько сотен тысяч особей бделлоидных коловраток и среди них не увидели ни одного самца — только самок. И никто у них никогда не наблюдал мейоза (это деление клетки, приводящее к образованию половых клеток). Несколько лет назад мы в составе большого международного консорциума секвенировали первый геном бделлоидной коловратки. Анализ показал, что классического мейоза у них точно не может происходить, так как у них отсутствуют парные хромосомы. Большинство генов, как и у нас, представлены в виде двух копий, но эти копии разбросаны по геному в мозаичном порядке.

— То есть это самки, размножающиеся, можно сказать, клонированием?

— В каком-то смысле, да. Но то, что у них нет классического полового размножения, не исключает вероятности того, что может существовать какой-то другой способ обмена генетическим материалом. Мы секвенировали геномы 11 коловраток, собранных в Московской области, чтобы изучить, как у них устроена генетическая изменчивость. Если у коловраток нет рекомбинации и обмена генетическим материалом, то, например, если мутация А произошла в контексте мутаций В и С, эти мутации и дальше будут оставаться сцепленными. А если рекомбинация происходит, то это сцепление будет разрываться, причем тем чаще, чем больше физическое расстояние между мутациями. И мы увидели именно такую картину — это сцепление разрывается. Значит, какие-то формы обмена генетическим материалом у коловраток происходят, хотя это и не классический мейоз. Возможно, именно поэтому им удалось так долго и успешно эволюционировать.

— А вашими методами можно узнать, что все-таки у них происходит?

— Это довольно сложно. Можно на основе того, как зависит скорость расцепления мутаций от расстояния между ними, попытаться понять, какой механизм лежит в основе этого.

— Ваш проект относится к чисто фундаментальной науке. Вы в Сколтехе имеете возможность заниматься такими исследованиями, которые пока не имеют никакой инновационной перспективы?

— Да, получается, что так.

«Самые интересные люди, которые занимаются биоинформатикой в России, собрались здесь»

Софья Гарушянц. 

 

 

Софья Гарушянц, мл. науч. сотр., научная группа сравнительной геномики проф. Михаила Гельфанда

— Софья, давайте поговорим про ваше исследование с кораллами.

— В последние годы в результате глобального потепления в мире большое количество кораллов оказалось поражено различными болезнями. Популяции просто трагически сокращаются, в случае Большого барьерного рифа — как минимум на 30–40%. Остаются только скелеты, а сами колонии вымирают. К нам в лабораторию пришли зоологи с кафедры зоологии беспозвоночных МГУ и принесли образцы больных и здоровых тканей кораллов. Мы своими методами пытаемся понять, какие именно организмы вызывают болезни, — сравниваем образец больной и здоровой ткани и смотрим, как они отличаются по бактериальному составу.

— Вы секвенируете геном коралла и бактерий?

— Мы используем подход, который называется метагеномика. Тотально секвенируем участки рибосомальной РНК, причем такие участки, которые есть у бактерий и которых нет у кораллов. Тем самым мы получаем набор всех бактерий, который есть в образце.

Этому проекту предшествовала другая работа. Мы проверяли гипотезу, что изменение внешнего вида кораллов (их разрастание) связано с маленькими рачками — копеподами, которые живут внутри колонии. Эти рачки выделяют какие-то вещества, и в результате на коралле образуется что-то типа галлов, как на растениях, а рачки питаются этими разрастающимися тканями. Мы проверяли, связаны ли эти разрастания с изменением бактериального состава. Была идея, что рачки переносят на кораллы какие-то бактерии, вызывающие болезни. Такая связь обнаружена, но не слишком очевидная.

— А про другие ваши работы расскажете?

— В наших бактериальных исследованиях объекты могут быть самыми разными. В конце прошлого года вышла статья, при написании которой мы сотрудничали с медицинскими микробиологами. В работе исследовались причины болезни Крона — это целая группа заболеваний, приводящих к воспалению кишечника. Часть из наблюдаемых случаев явно наследуемые, а часть спонтанные. Появилась гипотеза, что эта болезнь может быть связана с изменением состава микробиоты кишечника. У здорового человека в кишечнике порядка 300 видов бактерий, а при болезни Крона большую часть микробиома составляют кишечные палочки. Мы секвенировали геномы кишечных палочек, выделенных у пациентов, чтобы понять, какие особенности геномов могут быть связаны с их накоплением. И нашли, что в большинстве штаммов присутствуют специальные плазмиды, которые, видимо, и обеспечивают захват кишечника при болезни Крона.

— Софья, вы исходно биоинформатик? И что привело вас в Сколтех?

— Я училась на ФББ МГУ, но много лет работала в экспериментальной молекулярной биологии на кафедре вирусологии. А биоинформатикой занималась у Михаила Гельфанда в Институте проблем передачи информации (ИППИ РАН), и в Сколтех он позвал меня и еще нескольких сотрудников.

— Работа в Сколтехе дает возможность заниматься наукой в России?

— Очевидно, да. Хотя есть разные модели. В академическом институте тебе платят мало, зато у тебя фактически постоянная позиция. А здесь контракты ограничены по времени, но при этом зарплата сильно выше. Хотя при этом труднее получать гранты. Ну а еще мне нравится наш центр, потому что здесь очень сильный состав профессоров и заниматься биоинформатикой очень интересно. Мне кажется, что самые интересные люди, которые занимаются биоинформатикой в России, сейчас собрались здесь.

Вопросы задавала Надежда Маркина
Фото В. Шустикова и А. Поповича

  

Магистерская программа «Биотехнология» Сколтеха

Двухгодичный образовательный курс, включающий в себя как курсы по молекулярной и клеточной биологии, так и биоинформатические курсы и курсы по математическому моделированию в биологии. Изучая классические и современные подходы, студенты проводят исследования в области биомедицины и биотехнологии с использованием методов биоинформатики и компьютерной биологии. На программу «Биотехнология» приглашаются не только бакалавры по биологии и химии, но и физики, специалисты в области IT и анализа данных, выпускники медицинских и сельскохозяйственных вузов. Студенты-биотехи сотрудничают с различными биотехнологическими компаниями. Понимание того, как работает биомедицинский бизнес, помогает не только выбрать более успешный карьерный путь, но и стать более эффективным исследователем.

Программа аспирантуры Сколтеха по специальности «Науки о жизни» 

Программа рассчитана на четыре года. Аспиранты ведут исследования под руководством профессоров Сколтеха из Центра трансляционной биомедицины и Центра системной биомедицины и биотехнологии и могут защищаться по специальностям «молекулярная биология», «биотехнология» и «биоинформатика». Аспиранты имеют возможность посещать лекции ведущих профессоров Сколтеха, выбирая курсы, наиболее актуальные для их научной работы. Кроме курсов по специальности обязательными являются курсы по истории и методологии науки, предпринимательству и педагогике. Каждый аспирант обучается по индивидуальному плану, составляемому совместно с научным руководителем и утверждаемому индивидуальным комитетом, состоящим из известных ученых как из Сколтеха, так и из других российских и зарубежных университетов.

Больше о поступлении:

msc.skoltech.ru/biotekhnologiya

      

Источник: trv-science.ru

Страница не найдена |

Страница не найдена |

404. Страница не найдена

Архив за месяц

ПнВтСрЧтПтСбВс

     12

10111213141516

17181920212223

24252627282930

31      

       

       

     12

       

     12

       

      1

3031     

     12

       

15161718192021

       

25262728293031

       

    123

45678910

       

     12

17181920212223

31      

2728293031  

       

      1

       

   1234

567891011

       

     12

       

891011121314

       

11121314151617

       

28293031   

       

   1234

       

     12

       

  12345

6789101112

       

567891011

12131415161718

19202122232425

       

3456789

17181920212223

24252627282930

       

  12345

13141516171819

20212223242526

2728293031  

       

15161718192021

22232425262728

2930     

       

Архивы

Июн

Июл

Авг

Сен

Окт

Ноя

Дек

Метки

Настройки
для слабовидящих

Открытая Наука | Белки иммунной системы человека помогут в борьбе с

Ученые из Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины, Института биологии развития им. Н.К. Кольцова и МФТИ показали, что пептидогликан-распознающие белки иммунной системы могут сыграть ключевую роль в борьбе с хламидиозом. Исследование принято к публикации в журнале Infection and Immunity.

Жизненный цикл хламидий. Иллюстрация пресс-службы МФТИ

Хламидии — бактерии-паразиты, возбудители хламидиоза, болезни, которая заражает ежегодно более 90 миллионов человек в год. Это одно из самых распространенных заболеваний, передающихся половым путем, но инфекция также способна распространяться и через предметы, на поверхности которых бактерии выживают иногда свыше суток.

Хламидии могут существовать в двух формах: элементарных и ретикулярных телец. Элементарные тельца имеют хорошую защиту и приспособлены к выживанию в межклеточном пространстве, что позволяет им распространяться в организме и заражать другие клетки. Ретикулярные тельца не имеют постоянной формы и размера — они существуют внутри клетки-хозяина. В этой форме у хламидий происходит процесс размножения, и активизируется обмен веществ. Такой сложный жизненный цикл, в котором они постоянно переходят из одной формы в другую, позволяет хламидиям уходить от действия большинства антибактериальных белков.

Белки, распознающие пептидогликан — компонент клеточной стенки некоторых бактерий, являются частью иммунной системы человека. Избирательно взаимодействуя с определенными молекулами, они играют важную роль в борьбе с инфекциями. Ранее было показано, что такие белки могут присоединяться к пептидогликану и липополисахаридам в клеточной стенке бактерий и выводить из строя их систему реакции на стресс: Подобное нарушение в механизме регуляции внутриклеточного обмена веществ приводит к гибели микроорганизма. Как было известно, таким образом пептидогликан-распознающие белки могут уничтожать бактерии кишечной (Escherichia coli) и сенной (Bacillus subtilis) палочек, а их система реакции на стресс аналогична системе хламидий вида Chlamydia trachomatis.

Число хламидийных включений (число хламидий, внедрившихся в другие клетки.) через 48 часов после заражения в культурах клеток с тремя видами пептидогликан-распознающих белков и в контрольном образце. Вертикальная шкала логарифмическая, 1E7 означает 107 . Иллюстрация пресс-службы МФТИ.

На основе этих фактов исследователи выдвинули предположение, что пептидогликан-распознающие белки могут замедлять распространение хламидий.

Чтобы проверить это, ученые добавили растворы, содержащие исследуемые белки в культуру человеческих клеток. Затем клетки заразили хламидиями вида Chlamydia trachomatis и через 48 часов оценили количество включений. Предположение о том, что белки способны подавить рост бактерий подтвердилось, в сравнении с контрольными образцами (без исследуемого белка) их число уменьшилось в десять раз. При этом видимый антихламидийный эффект достигался при концентрациях белков в 20 раз больше, чем при их действии на E. coli и B. subtilis. Это, как считают исследователи, может быть связано со сложным жизненным циклом хламидий.

Уровни экспрессии двух генов системы (ctcB и ctcC) реакции на стресс в присутствии трех разных видов исследуемых белков и в контрольном образце для пяти разных моментов времени. Иллюстрация пресс-службы МФТИ.

Далее ученые проверяли гипотезу об уничтожении клеток через выведение из строя их системы реакции на стресс. Они оценили уровень экспресии (экспрессия — синтез веществ, передающих наследственную информацию гена в виде РНК) генов этой системы и проследили его изменение со временем. Оказалось, что в контрольном образце он оставался на базовом уровне, тогда как в образцах с белком наблюдались два пика — через час и через 72 часа после заражения. В это время хламидии находились в форме элементарных телец; ученые предполагали повышенную уязвимость к пептидогликан-распознающим белкам именно на этой стадии жизненного цикла бактерии, и их гипотеза подтвердилась экспериментально.

В ходе данной работы были подтверждены теории о строении и жизненном цикле хламидий, разработан способ выделения пептидогликан-распознающих белков при помощи генной инженерии, а также показано их действие на бактерии вида C. trachomatis.

«В дальнейшем результаты исследования могут быть применены для выяснения конкретного механизма действия пептидогликан-распознающих белков на хламидий. Представления о потенциальных мишенях для природных и синтетических агентов могут помочь в разработке лекарств, направленных на лечение хламидиоза»,

— прокомментировал свою работу автор исследования Павел Бобровский.

Как бактерии поддерживают и восстанавливают свою форму

Бактерии бывают самых разных форм и размеров — одни прямые, как стержень, другие скручиваются, как штопор. Форма играет важную роль в том, как бактерии проникают в клетки и атакуют их.

Спиральная форма Helicobacter pylori, вида бактерий, вызывающих язвы, может способствовать проникновению в ткани.

Бактерии обладают исключительной способностью сохранять и восстанавливать свою морфологию даже после искажения формы.Исследователи знают, что форма определяется клеточной стенкой, но мало что известно о том, как бактерии контролируют и контролируют ее. Поскольку клеточная стенка является целью большинства антибиотиков, понимание того, как бактерии растут свои клеточные стенки, может дать представление о более эффективных лекарствах.

Теперь группа исследователей во главе с Гарвардской школой инженерии и прикладных наук им. Джона А. Полсона (SEAS) обнаружила, что кишечная палочка (E. coli) может использовать механические сигналы, чтобы сохранять свою форму.

Исследование опубликовано в журнале Nature Microbiology.

«Это исследование может выявить некоторые основные принципы роста бактерий», — сказал Феликс Вонг, аспирант SEAS и соавтор статьи. «Мы показали, что связь роста клеточной стенки с механической деформацией количественно согласуется с тем, как бактерии восстанавливали свою форму после деформации в экспериментах».

Напряженная кишечная палочка со временем восстанавливает свою прямую палочковидную форму. (Изображения любезно предоставлены Ларсом Д. Реннером из Института исследований полимеров им. Лейбница и Центра биоматериалов Макса Бергмана, Дрезден, Германия.)

Вонг и старший автор Ариэль Амир, доцент кафедры прикладной математики, начали с моделирования механики клеточной стенки E. coli в условиях ограничений, которые вынудили бактерии вырасти в форму пончика.

В предыдущем исследовании Амир заметил, что при аналогичных изгибающих силах бактерии пластически деформируются, то есть, когда изгибающая сила была снята, клетки E. coli вернулись к более прямой, но все же изогнутой форме. Это предполагает, что рост клеточной стенки может ощущать приложенную силу изгиба.Амир также обнаружил, что клетки распрямляются при дальнейшем росте, наблюдение, которое не было разрешено в этой статье.

В последнем исследовании команда исследовала, может ли связь роста стенки с механической деформацией — как бактерия сжималась или растягиваться — может объяснить возврат и предсказать, как быстро бактерии будут выпрямляться при высвобождении.

Вонг и Амир ответили на этот вопрос с помощью теоретической модели, которая количественно предсказывала, как бактерии будут расти, чтобы вернуться к своей прямой форме, и сколько времени на это потребуется.

Затем вместе с экспериментальными группами докторов наук. Ларс Реннер и Свен ван Тиффелен из Института исследований полимеров им. Лейбница и Центра биоматериалов Макса Бергмана в Германии и Института Пастера во Франции соответственно провели эксперимент с кишечной палочкой.

Модели и эксперименты согласовывались друг с другом. Скорость роста клеточной стенки, зависящая от механической деформации, предсказывала скорость выпрямления, соответствующую тому, что было обнаружено экспериментально.

Теоретическая модель (слева) количественно предсказывает, как E.coli (справа), выращенные в замкнутых микрокамерах, со временем восстанавливают свою прямую стержневидную морфологию. (Видео любезно предоставлено Harvard SEAS)

«Мы думаем, что предложенная нами идея бактерий напоминает рост растений», — сказал Вонг. «В области растений хорошо известно, что механические сигналы могут влиять на рост растений. Наши исследования показывают, что то же самое можно сказать и о бактериях. Однако, если механические напряжения действительно были важным сенсорным сигналом для бактерий, то должен существовать молекулярный механизм, который воспринимает механическое напряжение.”

Затем исследователи надеются идентифицировать и понять те молекулярные механизмы, которые могут стать новыми мишенями для антибиотиков в будущем.

Соавторами статьи являются Гизем Озбайкал, Джейсон Полозе и Дуглас Б. Вейбель. Исследование было частично поддержано Национальным научным фондом, Фондом Volkswagen и Фондом Альфреда П. Слоуна.

Трансформация E. coli с использованием зеленого флуоресцентного белка


Информация для учителей Инструкции по безопасности

Хотя E.coli , использованный в этих экспериментах, был признан непатогенным, важно научить студентов методам стерилизации и безопасному удалению бактерий.

  • Во время эксперимента необходимо постоянно носить перчатки и защитные очки.
  • Держите нос и рот подальше от кончика пипетки при дозировании суспензионной культуры, чтобы избежать вдыхания любого аэрозоля, который может образоваться.
  • Используйте 10% раствор отбеливателя, чтобы протереть стол в конце эксперимента.
  • Вымойте руки перед выходом из лаборатории.

Для утилизации загрязненного материала:

Погрузите все одноразовые пипетки, пробирки и петли, которые контактировали с бактериями, в 10% -ный раствор отбеливателя не менее чем на 20 минут, прежде чем слить, промыть и выбросить в мусор.

По завершении лабораторной работы соберите все чашки Петри, откройте и погрузите в 10% раствор отбеливателя, чтобы убить все бактерии. Дайте материалам постоять в растворе отбеливателя не менее 20 минут.Слейте излишки раствора, запечатайте материалы в полиэтиленовый пакет и выбросьте в мусор.


Введение

Трансформация клеток — широко используемый и универсальный инструмент генной инженерии, имеющий решающее значение в развитии молекулярной биологии. Цель этого метода — ввести чужеродную плазмиду в бактерии, а затем бактерии амплифицируют плазмиду, создавая из нее большие количества.

Плазмида — это небольшой кольцевой фрагмент ДНК (от 2 000 до 10 000 пар оснований), который содержит важную генетическую информацию для роста бактерий.Бактерии, которые часто растут в той же среде, что и плесень и грибки, эволюционировали, чтобы произвести белки, которые инактивируют токсины, вырабатываемые этими другими организмами. Бактерии делятся этой жизненно важной информацией, передавая ее между собой в форме генов в плазмидах. Следовательно, естественная функция плазмиды — передавать генетическую информацию, жизненно важную для выживания бактерий. Именно эта характеристика плазмид используется для трансформации.

Чтобы бактерии могли принять плазмиду, их сначала нужно сделать «компетентными» для поглощения ДНК, которая обычно не проходит через мембрану бактериальной клетки.Это достигается путем создания небольших отверстий в бактериальных клетках путем суспендирования их в растворе с высокой концентрацией кальция. Затем ДНК может быть введена в клетки в соответствии с процедурами, выполняемыми во время этого эксперимента.

В этом упражнении студенты будут использовать штамм E. coli , который был сделан компетентным, чтобы позволить ему включать и экспрессировать плазмиду, содержащую два гена. Один ген кодирует зеленый флуоресцентный белок (GFP), а другой кодирует устойчивость к ампициллину.Источником гена GFP является биолюминесцентная медуза Aequorea victoria . Ген устойчивости к ампициллину позволяет нам выбрать, какие из клеток E. coli были трансформированы, исходя из их способности расти в среде, содержащей антибиотик ампициллин.

Рисунок 01 — Нажмите, чтобы увеличить


Цели
  1. Изучите методы рекомбинантной ДНК, в частности процедуру трансформации с использованием метода теплового шока.
  2. Узнайте об использовании маркерных или репортерных генов в экспериментах по молекулярной биологии и о том, как проводить скрининг на интересующий ген.
  3. Поймите, что ДНК может быть передана другому организму и, следовательно, изменить наблюдаемые характеристики этого организма.
  4. Ознакомьтесь со стерильной техникой и процедурами обеззараживания, которые используются для борьбы с бактериями.
  5. Узнайте, как рассчитать эффективность преобразования.


Материалы
    Для каждой лабораторной группы
  • Одноразовые перчатки
  • Защитные очки
  • Две микропробирки
  • Штатив для микропробирок
  • 6 одноразовых пипеток
  • 6 одноразовых петель для посева
  • Контейнер для бактериальных отходов
  • Стакан из пеноматериала с колотым льдом
  • 2 пластины со средой LB #
  • 2 пластины со средой LB + ампициллин #
  • Водостойкий маркер
  • Микропробирка, заполненная 50 мМ CaCl 2
  • Микропробирка, наполненная бульоном Лурия-Бертани
    Общие материалы
  • Бутылочки для сквирта, содержащие 10% отбеливателя
  • Микропипетка 20 мкл и наконечники только для инструктора
  • Водяная баня (с плавающими трубками)
  • Пластины с E.клетки coli высыпались и росли в течение ночи
  • плазмида pGREEN (0,005 мкг / мкл) +
  • Колотый лед
  • Дистиллированная вода
  • Инкубатор 37 ° C
  • Парафильм
  • УФ свет
  • Емкость с 10% отбеливателем для стерилизации всех предметов, контактирующих с бактериями.
  • Вам понадобится большой контейнер с 10% раствором отбеливателя для хранения всех использованных одноразовых пипеток и петель, а также для стерилизации чашек Петри. бактериальная питательная среда Лурия-Бертани, отвержденная агаром.В планшеты LB / Amp добавлен антибиотик ампициллин. Храните эти тарелки в холодильнике до использования. Если вы решите сделать свои собственные чашки, инструкции для 500 мл агара LB на 20-30 чашек следующие:

    Отмерьте 500 мл бульона LB в стеклянный стакан или колбу, добавьте 7,5 г (1,5 г на 100 мл раствора). бульон или 1,5%) агар. Прокипятите раствор на горячей плите или в микроволновой печи (два 40-секундных интервала с перемешиванием между ними). Используйте горячую подушку! Дайте немного остыть в течение нескольких минут, но не позволяйте ему затвердеть.Налейте примерно 20 мл (или глубиной около 3 мм) в каждую из 12-15 чашек Петри, используя стерильную технику (т. Е. Удерживайте крышки под углом чуть выше чашки во время заливки, чтобы защитить их от переносимых по воздуху частиц, немедленно накройте) и дайте возможность остудить не менее 15 минут. К оставшемуся раствору добавьте 1 мл ампициллина (10 мг / мл) на 100 мл раствора, а затем залейте остальные 12-15 чашек, как указано выше. Убедитесь, что вы правильно маркируете пластины. Эти тарелки можно хранить в холодильнике до 2 месяцев.

Примечание: Плазмида pGREEN содержит мутантную версию GFP, связанную с другим геном, называемым бета-галактозидазой. Эта комбинация генов была выбрана потому, что белок, произведенный из этой комбинации, окрашивает бактерии в желто-зеленый цвет даже при нормальном освещении. Если вы подвергнете колонии воздействию ультрафиолетового света, они также флуоресцируют. Плазмида также содержит ген устойчивости к антибиотикам, обеспечивающий рост в присутствии ампициллина.

Плазмидную ДНК следует хранить в холодильнике до тех пор, пока она не будет распределена для учащихся.Когда будете готовы, попросите учеников подходить к вам по одному и распределить плазмидную ДНК прямо в пробирки, помеченные знаком «+», чтобы указать, что в эти пробирки добавлена ​​плазмида.


Предварительная подготовка

День 1:

  1. Следуйте инструкциям на флаконах E.coli , чтобы приготовить планшеты за 24 часа до лаборатории.
  2. Аликвотные микропробирки с чуть более 1 мл 50 мМ CaCl 2 для каждой из двух лабораторных групп.
  3. Приготовьте 10% раствор отбеливателя для заполнения бутылочек для шприцев и больших контейнеров для утилизации.
  4. Получите достаточно колотого льда, чтобы заполнить поролоновые стаканы или химические стаканы для каждой лабораторной группы.
  5. Заполните водяную баню дистиллированной водой и нагрейте до 42 ° C.
  6. Удалите плазмидную ДНК pGREEN из морозильника непосредственно перед началом урока.
  7. Извлеките пластины LB и LB / Amp из холодильника и дайте им нагреться до комнатной температуры.
  8. Предварительно нагрейте инкубатор до 37 ° C.
  9. Аликвотируйте одну микропробирку с 1,5 мл бульона Лурия для каждых двух лабораторных групп.
  10. Имейте в наличии достаточное количество шприцевых бутылочек с 10% отбеливателем для каждой группы.

День 1 и 2 :
Подготовьте большой контейнер с 10% -ным раствором отбеливателя, чтобы ученики поместили в него использованные пипетки и петли и стерилизовали их чашки с агаром после анализа результатов трансформации.


Очистка после лаборатории

Когда все ваши занятия закончили пользоваться пластинами Петри, откройте чашки и погрузите их в раствор отбеливателя не менее чем на 20 минут.После стерилизации слейте жидкость, поместите посуду в полиэтиленовый пакет и выбросьте вместе с обычным мусором.

Утилизируйте трансформационные чашки Петри, начиная со 2-го дня, таким же образом.


Заметки учителя

Информация для учителя

Использование и утилизация E. coli:

См. Инструкции, прилагаемые к флаконам E.coli .

E.coli не считается патогенным, поскольку он является нормальной частью бактериальной флоры кишечника человека и редко ассоциируется с какими-либо заболеваниями у здоровых людей.Как отмечалось ранее, штамм E. coli , использованный в этом эксперименте, был признан непатогенным. Однако очень важно следовать приведенным ниже инструкциям по обращению с бактериями и утилизации отходов, чтобы обеспечить безопасное использование E.coli .

  • Не прикасайтесь к лицу при работе с планшетами или пробирками с E. coli на них, пока вы тщательно не вымыли руки. Не приближайтесь лицом к культурам или наконечникам при дозировании культур.
  • Не инкубируйте чашки дольше указанного времени, так как это может привести к заражению бактериями и грибками.
  • Следуйте всем инструкциям по очистке после лаборатории. Используя перчатки, соберите все чашки Петри, одноразовые пипетки и пробирки и погрузите их в 10% раствор отбеливателя на 20 минут или более, чтобы убить все бактерии. Слейте излишки раствора, поместите материалы в полиэтиленовый пакет и выбросьте вместе с обычным мусором
    . НЕ допускайте попадания отбеливателя на одежду , так как он навсегда запачкает ее.
  • Протрите лабораторный стол раствором отбеливателя в конце лаборатории.
  • Тщательно вымойте руки перед тем, как покинуть лабораторию.


Деятельность учащихся: Трансформация бактерии E. coli с использованием гена зеленого флуоресцентного белка


Чтение фона

В молекулярной биологии трансформация относится к форме генетического обмена, при которой генетический материал, переносимый отдельной клеткой, изменяется путем включения чужеродной (экзогенной) ДНК.Эта чужеродная ДНК может происходить из неродственных видов и даже из других царств, таких как бактерии, грибы, растения или животные, которые в противном случае были бы недоступны для организма.

Бактерии и дрожжи трансформированы человеческими генами с целью производства белков, которые полезны при лечении заболеваний и расстройств человека, например производство инсулина. Некоторые бактерии были модифицированы таким образом, что они могут переваривать масло от случайных разливов. Бактерии — это одноклеточные организмы, которые могут легко передавать информацию друг другу, и поэтому изменения в генетическом составе быстро передаются последующим поколениям.

Трансформация обычно более трудна для многоклеточных организмов, таких как растения, у которых необходимо либо изменить многие клетки новым фрагментом ДНК, либо изменить только одну клетку, а затем побудить ее произвести новое растение.

Генетическая трансформация растений и других организмов действительно происходит в естественных условиях. Бактерии и вирусы могут перемещать ДНК (или РНК) в организм и вызывать глубокие изменения. Примерами являются Agrobacterium tumefaciens (для растений) и ВИЧ (для людей).

Бактерия, которую вы будете трансформировать, E.coli , живет в кишечнике человека и представляет собой относительно простой и хорошо изученный организм. Его генетический материал состоит в основном из одного большого круга ДНК длиной 4–5 миллионов пар оснований (mbp) с небольшими петлями ДНК, называемыми плазмидами, обычно длиной от 5000 до 10000 пар оснований, присутствующими в цитоплазме. Именно эти плазмиды могут передаваться бактериями вперед и назад, что позволяет им обмениваться генами друг с другом и, таким образом, естественным образом адаптироваться к новой среде.

Способность бактерий поддерживать эти плазмиды и воспроизводить их во время нормального размножения клеток является основой трансформации клеток. Плазмиды используются в качестве «генных таксистов» в событиях трансформации, чтобы доставить интересующую ДНК в клетку, где она может интегрироваться в геном или оставаться в виде плазмиды внутри бактерии и транслироваться в белки, которые обычно не обнаруживаются в этом организме.

В этом эксперименте зеленый флуоресцентный белок (GFP) из биолюминесцентной медузы Aequorea victoria был включен в плазмиду вместе с геном устойчивости к антибиотику ампициллину.GFP на самом деле расположен в дискретных точках вокруг колоколообразного края медузы и будет флуоресцировать при определенных условиях.При вставке в плазмиду и использовании для процедуры трансформации трансформированные бактерии будут экспрессировать свой недавно приобретенный ген медузы и производить флуоресцентный белок, который заставляет их светиться зеленым в ультрафиолетовом свете. Мутантная форма GFP, используемая в pGREEN, придает бактериям желто-зеленый цвет даже при белом свете.

Эта плазмида содержит ген устойчивости к ампициллину в дополнение к гену GFP.Ампициллин — это антибиотик, который предотвращает образование клеточных стенок кишечной палочки E.coli , тем самым убивая бактерии. Когда присутствует ген устойчивости к ампициллину, он направляет производство фермента, который блокирует действие ампициллина, и бактерии могут выжить. Бактерии без плазмиды и, следовательно, без гена устойчивости не могут расти на планшете, содержащем ампициллин в среде, и выживут только трансформанты.


© Carolina Biological Supply Company, Используется с разрешения.

GFP также используется в исследованиях в качестве репортерной молекулы. Он может быть связан с белком, который вы хотите изучить, и затем за этим белком можно будет проследить изменения в экспрессии связанного GFP.


Цели
  1. Изучите рекомбинантные методы и процедуру трансформации с использованием метода теплового шока.
  2. Поймите, как мы можем проводить скрининг интересующего гена, и понять важность маркерных или репортерных генов в экспериментах по молекулярной биологии.
  3. Изучите, как ДНК может быть передана другому организму и какие изменения фенотипа (физических характеристик) могут возникнуть в результате такой передачи.
  4. Узнайте о важности стерильных методов, используемых для обработки бактерий, и о дезактивации, необходимой после завершения эксперимента.
  5. Узнайте, как рассчитать эффективность преобразования.

Материалы

    Для каждой лабораторной группы
  • Перчатки
  • Защитные очки по желанию
  • Водонепроницаемый маркер
  • Штатив для микропробирок
  • 6 одноразовых пипеток
  • 6 одноразовых петель для посева
  • Стакан из пеноматериала с колотым льдом
  • 2-фунтовые пластины
  • 2 пластины усилителя + LB
    Группы будут делить
  • Бутылочка для сквирта, содержащая 10% отбеливателя
  • Микропробирка, заполненная 50 мМ CaCl 2 (держать на льду)
  • Микропробирка с бульоном Лурия
    Общие материалы
  • Микропипетка 20 мкл для инструктора
  • Водяная баня (с плавающими трубками)
  • Штриховые пластины E.coli
  • плазмида pGREEN (0,005 мкг / мкл)
  • Колотый лед
  • Дистиллированная вода
  • Инкубатор 37 ° C
  • Парафильм
  • Большой контейнер с 10% отбеливателем

Меры предосторожности

Изучите инструкции по технике безопасности со своим учителем, чтобы убедиться, что вы знаете, как безопасно обращаться с культурами и оборудованием. По завершении лаборатории утилизируйте все материалы, замочив их в 10% растворе отбеливателя, затем слейте воду и поместите в мусорное ведро.Очистите лабораторные столы раствором отбеливателя и не забудьте, что вымойте руки, прежде чем покинуть лабораторию .


Процедура

День 1:

  1. Убедитесь, что у вас есть все материалы вашей группы, что вы знаете, с какой другой группой вы будете делиться и где находятся контейнеры с отбеливателем для очистки в конце.
  2. Наденьте перчатки и защитные очки.
  3. У вас есть две стерильные микропробирки: пометьте одну «+», а другую «-».Напишите название или инициалы своей лабораторной группы на каждой пробирке.
  4. С помощью одноразовой пипетки добавьте 250 мкл 50 мМ раствора CaCl 2 в каждую пробирку («+» и «-») и сразу же поместите их на лед.

  5. Используйте стерильную пластиковую петлю для переноса одной или двух колоний бактерий размером 3 мм или эквивалентного количества колоний меньшего размера с планшета для штриховки в пробирку «+». Не собирайте агар, так как он может замедлить процесс трансформации.
  6. Погрузите кончик петли в раствор хлорида кальция в пробирке со знаком «+» и энергично покрутите петлю, чтобы сместить клеточную массу и диспергировать всю массу в растворе хлорида кальция.Воздействие на клетки холодного раствора хлорида кальция в сочетании с «тепловым шоком», описанным на этапе 12 ниже, приводит к тому, что клеточная мембрана становится пористой, и, таким образом, клетки становятся «компетентными» для трансформации. Примечание: не должно оставаться видимых скоплений ячеек. Этот шаг очень важен для получения хороших результатов.
  7. Поместите петлю в контейнер для бактериальных отходов, чтобы убить оставшиеся на ней бактерии.
  8. Закройте крышку пробирки и положите пробирку на лед.
  9. Выполните шаги с 5 по 8 и используйте новую стерильную петлю для переноса массы клеток в пробирку со знаком «-».Обе пробирки теперь должны быть на льду.
  10. С помощью стерильной петли для посева возьмите одну петлю (10 мкл) pGREEN и добавьте непосредственно в CaCl 2 в вашей пробирке со знаком «+». Ваш учитель может сделать это за вас. После добавления плазмиды закройте крышку пробирки и осторожно постучите пальцем, чтобы перемешать. Старайтесь не разбрызгивать суспензию по стенкам трубки. Осторожно постучите основанием пробирки по столу, чтобы вся жидкость переместилась на дно пробирки.
  11. Верните трубку «+» на лед. НЕ добавляйте плазмиду в «-» пробирку. Инкубируйте обе пробирки на льду в течение 15 минут.
  12. Пока клетки инкубируются, ваш учитель будет пропускать УФ-лампу над раствором ДНК pGREEN. Запишите свои наблюдения в лист активности учащегося и ответьте на вопросы 1–3.
  13. После инкубации происходит «тепловой шок» клеток. Важно, чтобы клетки получили резкий и отчетливый толчок.
    а. Перенесите контейнер для льда с трубками на водяную баню 42 ° C.
    г. Удалите обе пробирки изо льда и немедленно подержите их в воде на 90 секунд. Три четверти трубки должны находиться под водой.
    г. После теплового шока немедленно верните пробирки в лед. Дайте им постоять на льду хотя бы одну минуту.

    Точка остановки: Пробирки можно поставить в холодильник на ночь и удалить непосредственно перед началом следующей лаборатории. Если вы не закончите лабораторную работу сегодня, отдайте пробирки учителю на хранение на ночь. Очистка: Поместите использованные петли и т. Д. В контейнер для бактериальных отходов.Обрызгайте рабочее место раствором отбеливателя и протрите бумажными полотенцами. Вымойте руки перед тем, как покинуть лабораторию.

  14. Используйте одноразовую пипетку, чтобы добавить 250 мкл бульона Лурия в пробирки «+» и «-». Убедитесь, что вы добавляете сначала в пробирку «-», чтобы избежать перекрестной контаминации плазмиды. Выбросьте эту пипетку вместе с бактериальными отходами.
  15. Закройте крышки и осторожно постучите по пробиркам, чтобы перемешать. Поместите в штатив и инкубируйте 10 минут при комнатной температуре.
  16. Пометьте НИЖНЯЯ часть ваших планшетов со средой во время инкубации пробирок.Не забудьте также указать название вашей лабораторной группы и дату.
  17. Этикетка 1 пластина LB и 1 пластина LB / Amp « + PLASMID » и наклейка 1 пластина LB и 1 пластина LB / Amp « -PLASMID »
  18. Используйте одноразовую пипетку, чтобы добавить 100 мкл клеточной суспензии из «- пробирка» к планшету « LB — PLASMID » и еще 100 мкл к планшету « LB / Amp — PLASMID ». Выбросьте пипетку и «пробирку» в контейнер для бактериальных отходов.
  19. Используя новую стерильную петлю для каждой чашки , равномерно распределите суспензии по поверхности агара, быстро перемещая плоскую поверхность новой стерильной петли вперед и назад по поверхности чашки.Поверните тарелку на четверть оборота и еще несколько раз пройдите вперед-назад.
  20. Используйте новую стерильную пипетку для переноса 100 мкл клеточной суспензии из пробирки со знаком «+» в каждый соответствующий планшет и распределите, как указано выше.
  21. Поставьте планшеты на стол на 10 минут, чтобы суспензия клеток впиталась в среду.
  22. Оберните парафильмом четыре пластины, чтобы закрыть крышки. Поместите чашки вверх дном в инкубатор или при комнатной температуре. Результаты будут готовы для наблюдения через 24 часа при инкубации при 37 ° C или через 48-72 часа при инкубации при комнатной температуре.
  23. После того, как наконечники и пробирки будут находиться в растворе отбеливателя не менее 20 минут, слейте жидкость в контейнер для бактериальных отходов в канализацию. Соберите наконечники и пробирки в полиэтиленовый пакет и выбросьте их вместе с обычным мусором. Сбрызните рабочее место раствором отбеливателя. Вымойте руки перед тем, как покинуть лабораторию.

День 2:

  1. Извлеките чашки из инкубатора или другого хранилища и проверьте рост. Заполните оставшуюся часть рабочего листа, который вы начали в первый день лабораторной работы.
  2. Откройте чашки Петри и погрузите в большой контейнер с раствором отбеливателя, предоставленным вашим инструктором. Сбрызните рабочее место раствором отбеливателя. Вымойте руки перед тем, как покинуть лабораторию.


Студенческая деятельность

  1. Какого цвета была плазмидная ДНК pGREEN, когда мы экспонировали ее УФ-светом?
  2. На всех ли тарелках будут расти бактерии?
  3. Объясните свой ответ на вопрос 2.
  4. Теперь понаблюдайте за результатами на чашках Петри, не снимая крышек.Подсчитайте, сколько колоний присутствует на каждой чашке. Если их слишком много, чтобы сосчитать, запишите «лужайку». Запишите свои результаты на диаграммах ниже.

  5. Ваши результаты отличались от ожидаемых? Объясните, что, по вашему мнению, могло произойти.
  6. Какие пластины являются контрольными? Зачем нужны контрольные пластины?
  7. Только на одной пластине есть трансформанты. Это экспериментальная пластина. Который из них? Почему на этой чашке растут только трансформанты?
  8. Посветите ультрафиолетовым светом на пластину с трансформантами.Какого цвета бактерии? Сравните этот ответ с тем, что вы наблюдали, когда свет падал на плазмиду pGREEN. Есть разница? Почему?
  9. Были ли трансформированы все бактерии, с которых мы начали? Сравните рост на пластинах 2 и 4 и затем объясните свой ответ.
  10. Эффективность трансформации определяется как количество трансформированных колоний на микрограмм (мкг) плазмидной ДНК. Чтобы определить эффективность трансформации, нам необходимо определить начальное количество (массу) плазмиды, которая была распределена на планшете, и связать это с количеством трансформированных колоний, которые наблюдались на экспериментальном планшете.

    Формула для определения эффективности трансформации:

    Общее количество колоний, растущих на LB / amp на мкг плазмидной ДНК, использованной для трансформации

    a) Для определения начального количества (массы) плазмидной ДНК:
    Общее количество ДНК [мкг] = концентрация [мкг / мкл] X объем [мкл] Помните, вы использовали 10 мкл плазмидной ДНК в концентрации 0,005 мкг / мкл

    b) Для определения доли растекания раствора ДНК :
    Объем раствора, нанесенного на чашку, деленный на общее количество в пробирке = разброс фракций

    c) Для определения степени распространения ДНК на экспериментальном планшете:
    Общее количество плазмидной ДНК [мкг] X распространение фракции = количество распространения ДНК

    г) Число колоний на мкг плазмидной ДНК:
    Число наблюдаемых колоний, деленное на количество распространенной ДНК = эффективность трансформации


Ответы на действия учащихся
  1. Плазмида не флуоресцирует зеленым.
  2. Бактерия не может расти в присутствии антибиотика ампициллина, если она не содержит плазмиду, и поэтому на пластине LB / Amp бактерий без плазмиды не будет роста.
  3. См. Изображение выше.
  4. На планшете 1 из-за отсутствия антибиотика бактерии дикого типа росли нормально и образовывали «лужайку» по всей пластине.

    На планшете 2 трансформированные бактерии все еще могут расти, образуя «лужайку», поскольку антибиотик, подавляющий рост бактерий без плазмиды, отсутствует.
    На планшете 3 нетрансформированные бактерии не могут расти в присутствии антибиотика, так как стенки бактериальных клеток не могут образовываться и бактериальные клетки погибают.
    На планшете 4 любые бактерии, трансформированные путем поглощения плазмиды pGREEN, теперь могут расти в присутствии антибиотика, поскольку плазмида также содержит ген, обеспечивающий устойчивость к антибиотикам. Эти бактерии также будут светиться зеленым.

  5. Планшеты № 1 и 2 являются положительными контролями, а планшет № 3 — отрицательным контролем.На каждой из этих пластин проверяется различная комбинация компонентов эксперимента, чтобы убедиться, что все они функционируют должным образом.
  6. Пластина номер 4 содержит трансформанты, поскольку это пластина, содержащая антибиотик, который позволяет расти только бактериям, содержащим плазмиду pGREEN и ее ген устойчивости к антибиотикам.
  7. Трансформированные бактериальные колонии светятся зеленым при освещении УФ-светом. Когда УФ-свет освещал плазмиду в пробирке, не было видимой флуоресценции, потому что на свет реагирует не плазмида, а белок, продуцируемый при трансляции гена в плазмиде.Это производство белка происходит только после того, как плазмида была включена в бактерии.
  8. Если бы все бактерии были трансформированы, то на планшете 4 была бы «лужайка» роста, такая же, как на планшете 2. Только ограниченное количество бактерий действительно включает плазмиду в свои клетки в ходе этого эксперимента.
  9. a) Общая масса = 10 мкл x 0,005 мкг / мкл = 0,05 мкг
    b) Разброс по фракции = 100 мкл / 510 мкл = 0,196
    c) Масса распространения плазмидной ДНК = 0.05 мкг x 0,196 = 0,0098 мкг
    d) Эффективность трансформации = x колоний на планшете 4 / 0,0098.
    Ответы могут быть разными, но они должны находиться в диапазоне 10 3 -10 4 трансформантов / мкг ДНК.

Примечание: Факторы, влияющие на эффективность трансформации, включают технические ошибки, температуру и продолжительность инкубационного периода, стадию роста клеток и использование правильной массы плазмидной ДНК.

Приведенный выше протокол был изменен из Калифорнийского университета в Дэвисе.На приведенном ниже веб-сайте представлена ​​информация и изображения трансформации и регенерации эксплантата томата с использованием Agrobacterium tumefaciens для переноса сконструированной ДНК в клетку томата. http://ppge.ucdavis.edu

Определение, формы, характеристики, типы и примеры

Определение бактерий

Бактерии — это одноклеточные микроорганизмы с прокариотическими клетками, которые представляют собой одиночные клетки, не имеющие органелл или истинного ядра и менее сложные, чем эукариотические клетки.Бактерии с большой буквы относятся к области бактерий, одной из трех сфер жизни. Две другие области жизни — это археи, членами которых также являются одноклеточные организмы с прокариотическими клетками, и эукариоты. Бактерии чрезвычайно многочисленны, а общая биомасса бактерий на Земле больше, чем у всех растений и животных вместе взятых.

Эволюция бактерий

Бактерии впервые возникли на Земле примерно 4 миллиарда лет назад, и они были первыми формами жизни на Земле.В течение 3 миллиардов лет бактерии и археи были наиболее распространенными видами организмов на Земле. Многоклеточные эукариоты появились примерно 1,6–2 миллиарда лет назад. Эукариотические клетки, из которых состоят все простейшие, грибы, животные и растения, также содержат то, что когда-то было бактериями; Считается, что митохондрии эукариот, которые производят энергию посредством клеточного дыхания, и хлоропласты растений и водорослей, производящие энергию посредством фотосинтеза, произошли от бактерий, которые попали в клетки в результате эндосимбиотических (взаимовыгодных) отношений, которые стали постоянными. со временем.

Характеристики бактерий

Бактерии — одноклеточные организмы. В них отсутствуют органеллы, такие как хлоропласты и митохондрии, и у них нет настоящего ядра, обнаруженного в эукариотических клетках. Вместо этого их ДНК, двойная цепь, которая является непрерывной и кольцевой, расположена в нуклеоиде. Нуклеоид представляет собой область неправильной формы, не имеющую ядерной мембраны. Бактерии также имеют клеточную мембрану и клеточную стенку, которая часто состоит из пептидогликана. Вместе клеточная мембрана и клеточная стенка называются клеточной оболочкой.Многим бактериям для выживания нужна клеточная стенка.

Размножение происходит посредством бинарного деления, которое представляет собой расщепление бактериальной клетки после того, как она достигает определенного размера. Бактерии размножаются бесполым путем, поэтому две дочерние клетки, образовавшиеся в результате бинарного деления, имеют ту же ДНК, что и родительская клетка. Однако некоторые бактерии также могут обмениваться генетическим материалом друг с другом в процессе, известном как горизонтальный перенос генов. В этом методе участвуют две уже существующие бактерии; это не форма передачи от родителей к ребенку.

Формы бактерий

Бактерии бывают самых разных форм. Три основных вида бактерий: кокк, спираль и палочка.

  • Кокки — это бактерии сферической или яйцевидной формы. Некоторые кокки остаются прикрепленными после бинарного деления, даже если образовались отдельные клетки. Например, диплококки — это пары кокков, стрептококки — цепочки, а стафилококки — скопления нескольких кокков. Тетрады представляют собой квадратные формы из четырех кокков, а сарцины — это кубики из восьми кокков.
  • Спиральные бактерии, как следует из названия, имеют спиралевидную форму. Спириллы представляют собой толстые жесткие спирали. Спирохеты — это тонкие и гибкие спирали. Вибрионы представляют собой стержни в форме запятой с небольшой закруткой.
  • Бациллы представляют собой палочковидные бактерии. Подобно коккам, бациллы могут быть по отдельности или собраны вместе. Диплобациллы — это две бациллы, расположенные рядом друг с другом, а стрептобациллы — это цепочки бацилл.

Бактерии также могут иметь другую форму, например нитевидные (длинные и тонкие), квадратные, звездообразные и стебельчатые.На этой диаграмме изображены многочисленные формы бактерий.

Диаграмма морфологии бактерий

Типы бактерий

Клеточная стенка также делает возможным окрашивание по Граму. Окрашивание по Граму — это метод окрашивания бактерий с использованием красителя кристаллического фиолетового, йода и контрастного красителя сафранина. Многие бактерии можно разделить на два типа: грамположительные, которые показывают пятно и выглядят фиолетовыми под микроскопом, и грамотрицательные, которые показывают только контрастное пятно и выглядят красными.Грамположительные бактерии выглядят фиолетовыми, потому что у них есть толстые клеточные стенки, которые удерживают комплекс кристаллического фиолетово-йода. Тонкие клеточные стенки грамотрицательных бактерий не могут удерживать фиолетово-йодный комплекс, но они могут удерживать сафранин. Это заставляет грамотрицательные бактерии казаться красными при окрашивании по Граму. Окрашивание по Граму используется для общей идентификации бактерий или для обнаружения присутствия определенных бактерий; его нельзя использовать для идентификации бактерий каким-либо определенным образом, например, на уровне видов. Примеры грамположительных бактерий включают роды Listeria, Streptococcus и Bacillus , а грамотрицательные бактерии включают Proteobacteria, зеленые серные бактерии и цианобактерии.

Примеры бактерий

Escherichia coli — один из примеров распространенных видов бактерий. Он имеет форму бациллы и естественным образом обнаруживается в кишечнике многих животных, включая человека, где производит витамин К и витамины группы B. E. coli также часто используется в лабораторных исследованиях, поскольку она быстро размножается и является морозостойкой. Большинство штаммов E. coli безвредны для человека, но некоторые могут вызывать инфекцию. Инфекция E. coli может привести к желудочно-кишечным проблемам, таким как диарея, а в более тяжелых случаях может возникнуть бактериальный менингит или пневмония.

Lactobacillus acidophilus — еще один бацилловидный вид бактерий, который естественным образом встречается в таких местах, как кишечник и влагалище, где он защищает от вредных бактерий. Это пробиотик, бактерия, содержащаяся в определенных продуктах, таких как йогурт и другие ферментированные продукты, которые потребляются для того, чтобы помочь усвоить питательные вещества и пополнить запасы «хороших» бактерий в организме. Его также могут употреблять в небольших количествах люди с непереносимостью лактозы, чтобы помочь им потреблять лактозу.

Некоторые бактерии могут быть чрезвычайно опасными, например Clostridium botulinum , бактерии, вызывающие ботулизм. C. botulinum производит нейротоксин ботулизм, который отвечает за симптомы ботулизма. Симптомы включают нечеткость зрения, тошноту, затрудненное дыхание, мышечную слабость и паралич. Ботулинический токсин — самый смертоносный из известных токсинов; всего одного килограмма ботулина было бы достаточно, чтобы убить все человечество.

  • Прокариот — организм, имеющий простую прокариотическую клетку; бактерии и археи — прокариоты.
  • Бинарное деление — Метод, при котором бактерии размножаются бесполым путем путем деления.
  • Пробиотик — бактерия, которая помогает поддерживать здоровье пищеварительного тракта при употреблении.
  • Горизонтальный перенос генов — перенос генов между двумя организмами, которые не являются родителями и потомками.

Тест

1. Как размножаются бактерии?
A. Половое размножение
B. Горизонтальный перенос генов
C. Двоичное деление
D. Митоз

Ответ на вопрос № 1

C правильный. Бактерии размножаются бесполым путем посредством бинарного деления. Они также могут обмениваться генами с другими бактериями посредством горизонтального переноса генов, но это не размножение, поскольку оно не предполагает создания потомства. Митоз похож на бинарное деление, но митоз происходит только в эукариотических клетках.

2. Какая бактерия не является одной из трех основных форм?
А. Coccus
B. Bacillus
C. Spiral
D. Star

Ответ на вопрос № 2

D правильный. Звездообразные бактерии, такие как представители рода Stella , не так распространены, как кокки, бациллы и спиральные бактерии.

3. Когда бактерии впервые начали существовать на Земле?
A. 4 миллиарда лет назад
B. 2 миллиарда лет назад
C. 1,6 миллиарда лет назад
D. 1 миллиард лет назад

Ответ на вопрос № 3

правильный. Бактерии впервые возникли около 4 миллиардов лет назад. Это самые старые формы жизни на планете. Эукариоты начали появляться намного позже, примерно 1,6–2 миллиарда лет назад.

Новый метод изучения механики клеток

Abstract

Механические свойства бактериальных клеток определяются их элементами, несущими нагрузку. Размер типичных бактериальных клеток и тот факт, что различные масштабы времени и длины определяют их поведение, требуют специальных экспериментальных методов для исследования их механических свойств в различных пространственно-временных условиях.Здесь мы представляем такой экспериментальный метод для изучения механики клеток с использованием гидродинамических сил в микрофлюидном устройстве. Мы демонстрируем применение этого метода, вычисляя жесткость при изгибе нерастущих клеток Escherichia coli . Кроме того, мы сравниваем деформацию нитчатых клеток в условиях роста и отсутствия роста в процессе деформации. Мы показываем, что при низких усилиях сила, необходимая для деформации растущих клеток в той же степени, что и нерастущих клеток, примерно в два раза меньше.Следуя предыдущим работам, мы интерпретируем эти результаты как результат разницы между эластическим ответом нерастущих клеток и пластически-эластическим ответом растущих клеток. Наконец, мы наблюдаем некоторую неоднородность реакции отдельных клеток на приложенную силу. Мы предполагаем, что это связано с индивидуальностью различных бактериальных клеток.

Образец цитирования: Caspi Y (2014) Деформация нитчатых клеток Escherichia coli в микрожидкостном устройстве: новый метод изучения механики клеток.PLoS ONE 9 (1): e83775. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083775

Редактор: Лоран Креплак, Университет Далхаузи, Канада

Поступила: 20 января 2013 г .; Одобрена: 14 ноября 2013 г .; Опубликовано: 2 января 2014 г.

Авторские права: © 2014 Ярон Каспи. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта исследовательская работа была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения США www.nih.gov/ (грант P50 GM068763). Однако подача этой статьи осуществляется без поддержки какого-либо гранта или финансирования. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Автор заявил, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Бактериальные клетки используют свою клеточную стенку пептидогликана [1], [2] и цитоскелет [3] — [6] как элементы, несущие стресс, чтобы уравновесить силу расширения тургорного давления [5], [7] .В течение многих лет было трудно количественно измерить механические свойства этих элементов. Десять лет назад атомно-силовая микроскопия (АСМ) была впервые использована для измерения модуля Юнга извлеченных регидратированных мешочков грамотрицательных бактерий [8]. Впоследствии АСМ стал стандартным методом исследования механической реакции бактериальных клеток (обзоры см. В ссылках [9] — [11]). Недавние примеры включают измерения размягчения клеток после атаки фагами [12] и измерения вязкоупругого ответа клеточной оболочки [13], [14].

Один из важных вопросов, который не рассматривался, — это влияние процессов роста на механику бактериальных клеток. Почему между ними должна быть связь? Чтобы ответить на этот вопрос, важно отметить, что бактериальный морфогенез тесно связан с ростом [15] — [17]. Например, изогнутая конформация Caulobacter crescentus поддерживается за счет асимметричного введения нового материала клеточной стенки с двух сторон клетки во время процесса роста [18], [19].Точно так же скоординированная релаксация поперечных сшивок пептидогликана во время роста Helicobacter pylori отвечает за его спиральную форму [20]. Теоретический анализ предполагает, что локальный контроль скорости, процессивности и степени вставки пептидогликана может быть общим механизмом для создания изогнутой конформации [21], [22]. С другой стороны, механические силы per se также могут формировать бактерии и контролировать их морфогенез [23], [24]. Например, упругие свойства клеточной стенки и механические силы, действующие на нее со стороны жгутиков, полностью определяют изогнутую форму Borrelia burgdorferi [25].Т.о., поскольку и процессы роста, и прямые механические силы важны для морфогенеза, интересно спросить, существует ли прямая связь между ростом клеток и механикой клеток.

Традиционный АСМ, однако, страдает двумя ограничениями, которые мешают его способности исследовать такую ​​связь. Во-первых, иммобилизация клеток на поверхности может по-разному влиять на результаты измерений [26], [27]. Во-вторых, шкала времени измерений обычно медленная по сравнению со скоростью роста бактерий.Последние достижения в области высокоскоростной АСМ позволяют обойти это ограничение по шкале времени [28]. Действительно, в последние несколько лет высокоскоростная АСМ использовалась для исследования в реальном времени динамики атаки антимикробным пептидом на Escherichia coli ( E. coli ) [29], а также динамического движения поверхности ультраструктуры в Magnetospirillum Magneticum [30]. Тем не менее, прямое измерение параметров механики клеток в режиме реального времени остается сложной задачей. Таким образом, могут потребоваться дополнительные экспериментальные методы, чтобы исследовать взаимосвязь между ростом клеток и механикой клеток.

Несколько лет назад оптический пинцет использовался для изучения механики бактериальных клеток [31]. В этом методе шарик прикреплялся к кончику ячейки и вытягивался с помощью оптического пинцета, в то время как другой конец ячейки был иммобилизован на покровном стекле. Результаты этого измерения позволили предположить, что цитоскелет MreB вносит вклад, по крайней мере, в изгибную жесткость грамотрицательных бактерий. Однако, опять же, рост клеток не учитывался.

Совершенно иной подход был использован Tuson et al.который недавно измерил продольный модуль Юнга растущих бактериальных клеток с помощью гидрогелей с регулируемой эластичностью [32]. Чтобы измерить продольный модуль Юнга, бактерии инкапсулировали в гель и количественно оценивали деформацию геля в процессе роста. Их результаты показали, что продольный модуль Юнга у разных видов бактерий похож, но, в отличие от жесткости при изгибе, на продольный модуль не влияет деполимеризация MreB.Эти результаты подчеркивают важность процесса роста в пространстве параметров клеточной механики. Однако из-за характера этого метода его нельзя применять для исследования боковой жесткости растущих бактерий.

Здесь мы представляем простой и легко доступный подход с использованием микрофлюидного устройства для исследования механики бактериальных клеток в режиме реального времени и изучения его связи с ростом на уровне отдельных клеток. В последнее десятилетие микрофлюидные технологии становятся все более важными для биологического инструментария [33].Многочисленные исследования использовали его для изучения механики эукариотических клеток (см. Обзор [34]). Мы использовали его преимущества для разработки установки для изучения взаимосвязи между ростом и клеточной механикой палочковидных бактериальных клеток. Наше устройство состоит из набора тупиковых каналов (обозначенных как «каналы роста»), которые своим открытым концом соединены с большим проточным каналом («основной канал» — см. Рисунок 1 и рисунок S1). Мы выращиваем клеток E. coli в нитевидную форму внутри нашего микрофлюидного устройства.Каналы роста служат опорными точками, которые позволяют избежать необходимости постоянной иммобилизации. Поток жидкости в основном канале позволяет нам воздействовать на клетки гидродинамическими силами, чтобы деформировать их и одновременно создавать различные условия окружающей среды для управления условиями их роста. Таким образом, мы можем напрямую исследовать связь между ростом нитчатых клеток и их деформацией. Мы использовали этот подход, чтобы измерить жесткость клеток на изгиб и показать, что при низких усилиях требуется меньшая сила, чтобы деформировать растущие клетки в той же степени, что и нерастущие, из-за пластичности растущих клеток. клетки.

Результаты

Боковая деформация нерастущих клеток

(i) Нерастущие клетки E. coli эластично деформируются. Чтобы вырастить клетки в нитевидную форму внутри микрофлюидного устройства, мы загрузили их из культуры LB и индуцировали экспрессию SulA под промотором Plac. SulA принадлежит к системе SOS-ответа E. coli, а ингибирует образование кольца FtsZ и, таким образом, деление клеток [35] — [37].Во время филаментации в устройство постоянно вливали свежую среду LB, пока клетки не стали короче каналов роста. На этом этапе инфузия среды была остановлена, и клетки оставили расти в виде прямых стержней, проникающих в основной канал. Когда часть нитчатых клеток в основном канале была длинной, мы на короткое время вливали буфер А в устройство (чистые соли M9, азид натрия, IPTG — см. Материалы и методы). Двойной эффект истощения запасов углерода и блокирования синтеза АТФ практически сразу останавливает рост клеток.Мы поддерживали IPTG в буфере A, чтобы гарантировать, что даже в течение времени, необходимого для остановки роста, деление клеток будет продолжать подавляться. Следует отметить, что замена буфера приводит к появлению гидродинамических сил, которые могут изменять конформации клеток. Таким образом, мы разработали протокол, который минимизировал поток во время обмена, но обещал, что клетки перестанут расти в течение короткого периода в несколько минут (см. Материалы и методы). Тем не менее, даже при использовании этого протокола некоторые клетки деформировались до того, как их рост прекратился.Далее мы изучали только клетки с почти прямой конформацией после остановки роста и размером части в основном канале менее чем. После того, как клетки перестали расти, как было заключено из сравнения покадровых изображений, им позволяли расслабиться в течение дополнительных минут в буфере А, но без потока, чтобы гарантировать, что остаточный рост все еще не продолжался. Наконец, механический ответ клеток изучали путем вливания буфера А с определенной скоростью потока и регистрации деформации клеток.Пример деформации ячейки под действием боковой силы показан на рисунке 2 (A). После приложения силы клетка быстро деформировалась, пока не достигла конформации устойчивого состояния (обратите внимание на большую разницу во времени между панелями (5) и (6)).

Рис. 2. Деформация нерастущей клетки (A) и растущей клетки (B).

Поток был справа налево. Скорость инфузии была. Для нерастущей клетки (А) клетка не деформировалась по всей своей длине за пределами ростового канала.Скорее, деформация, по-видимому, происходит в ограниченной области вокруг выхода из канала роста. Обратите внимание на разницу во времени между панелями (6) и панелями (1-5), показывающими, что через несколько минут клетка приобрела конформацию в устойчивом состоянии. Что касается растущей ячейки (B), по мере того, как ячейка врастала в основной канал, и при приложении достаточной силы она деформировалась. Первоначально деформация напоминала изгибание нерастущих клеток. По мере того, как клетка становилась длиннее, она больше деформировалась из-за прямой конформации.Наконец, он вырос по горизонтали.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083775.g002

Тот факт, что нерастущие клетки деформировались под действием силы, заставил нас задаться вопросом, сохранят ли они свою предварительно сформированную конформацию при снятии силы. В противном случае деформация, вероятно, связана с необратимым изменением клеточной структуры; тогда как если они это сделают, деформация, вероятно, будет упругой. Чтобы различать эти две возможности, мы ослабили силу, уменьшив скорость потока до минимального значения, и позволили жидкости одновременно выходить из одного из впускных и выпускных отверстий.Мы использовали эту процедуру вместо полной остановки потока, чтобы избежать различий в базовой силе из-за переходных потоков в устройстве. Типичный пример релаксации одиночной ячейки показан на рисунке 3 (A). Как можно видеть, когда сила была снята, клетка восстанавливает свою заранее сформированную конформацию в течение короткого периода времени (мин., Вставка на фиг. 3 (A)). Мы полагаем, что эта шкала времени представляет в основном время релаксации потока в нашем устройстве, а не любую внутреннюю шкалу времени, которая связана с (пере) деформацией ячейки.

Рисунок 3. Расслабление растущих и нерастущих клеток.

(A) Релаксация нерастущей клетки до ее естественной конформации после минимизации потока. Клетка релаксировала до своей исходной конформации через 1,5 мин. Врезка — конформация клетки до приложения силы. (B) Изменения в деформации растущей клетки после остановки потока. Клетка немного выпрямилась, но продолжала расти в изогнутой форме. В обоих случаях исходный поток был остановлен или минимизирован после первого момента времени, как описано в тексте.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083775.g003

Мы также продемонстрировали, что нерастущие клетки расслабляются до своей естественной конформации, выполнив два поддерживающих эксперимента. Во-первых, мы изучили деформацию клетки с помощью повторяющегося приложения силы, за которым следовала фаза восстановления. График горизонтального отклонения кончика клетки от положения центра канала роста показан на рисунке 4 (A). Во-вторых, мы применили поток нерастущей клетки в течение полутора часов, а затем позволили ей восстановиться (см. Рисунок 4 (B) — (C) и рисунок S2).В обоих случаях клетки расслабились до своего предварительно сформированного состояния после снятия силы. Таким образом, мы пришли к выводу, что нерастущие клетки упруго деформировались в нашем устройстве и не подвергались пластической деформации под действием применяемых сил.

(ii) Характеристика деформации нерастущих клеток. Показав, что нерастущие клетки упруго деформируются в нашем приборе, мы обратились к более детальному изучению их деформации. Во-первых, мы рассмотрели деформацию нерастущих клеток при многократном повторении процессов деформации и релаксации, аналогичных описанным выше, при увеличении скорости инфузии в устройстве (и, следовательно, силы) от значения до (или если клетка не сбежала).Используя собственный код Matlab и макрос ImageJ (см. Материалы и методы), мы извлекли форму средней линии ячеек и охарактеризовали каждую ячейку ее угловым профилем между касательной к сегментам средней линии и осью (см. Материалы и методы, рисунок 1 и рисунок S3). По причинам, которые объясняются ниже, мы проанализировали степень деформации, используя значение, где в обоих случаях значение определяется подгонкой касательного вектора для первых или последних нескольких микрон ячейки к прямой линии.Набор результатов для различных клеток показан на рисунке 5. Как можно видеть, линейно увеличивается с увеличением скорости инфузии (и, следовательно, силы). Линейная аппроксимация результатов этих четырех ячеек плюс одна другая (данные не показаны) дала значение для наклона, где — скорость инфузии. Ниже этот результат сравнивается с аналогичным результатом для деформации растущих клеток.

Далее мы исследовали деформацию ячеек с длиной дуги до. Результаты соотношения между и длиной дуги () показаны на рисунке 6 (см. Также таблицу S1).Как видно, увеличивается линейно как функция. Примечательно, что мы наблюдали некоторую вариацию от ячейки к ячейке в склонности к деформации под действием силы (примерно, как выводится из стандартного отклонения линейной аппроксимации результата). Следовательно, при одинаковом значении потока несколько ячеек деформируются больше, чем другие. В принципе, это может быть результатом: (i) влияния начальной фазы роста клеток до того, как они были введены в микрожидкостное устройство, (ii) отклонений в поле потока между различными случаями или (iii) изменчивости боковой жесткости. отдельных ячеек.Чтобы проверить первую возможность, мы построили график зависимости от О. клеток при инъекции в устройство, но не обнаружили никакой корреляции между двумя параметрами (данные не показаны). Мы проверили вторую возможность, введя флуоресцентные шарики (), пока клетки заполняли устройство, и проследив влияние клеток на траектории шариков. Мы наблюдали отклонения от прямых траекторий и, следовательно, ламинарный поток, только прилегающий к границам ячеек (см. Фильм S1, фильм S2).Таким образом, наличие ячеек не оказало значительного влияния на профиль потока в устройстве. Поэтому мы предпочитаем последнее объяснение, что вариабельность от клетки к клетке ответственна за разброс результатов. Однако, поскольку мы не измеряли непосредственно профиль поля потока в каждом случае, мы не можем исключить отклонения поля потока как источник изменчивости от ячейки к ячейке.

(iii) Расчет жесткости на изгиб. Поскольку ячейки в нашем устройстве ведут себя упруго, и поскольку их длина дуги намного больше их диаметра (), мы можем рассчитать их жесткость на изгиб (), которая является произведением модуля Юнга и второго момента инерции (), из классическая упругая теория изгиба тонких стержней [38].На практике мы решали уравнения упругости для использования решателя краевых задач Matlab bvp4c с изгибной жесткостью в качестве свободного параметра. Для расчета мы использовали внешнюю гидродинамическую силу в явном виде для потока в замкнутом канале с высоким аспектным отношением, как указано Гондретом и др. [39] (см. Текст S1 и текст S2). Однако следует отметить выбор граничных условий. Очевидно, что кончик ячейки в наших устройствах свободный (и положение, и направление произвольно).Напротив, основание ячейки следует граничному условию с опорой, то есть оно может скользить в точке опоры, но не может подвергаться поперечному смещению. Тот факт, что основание клетки поддерживается, очевиден, поскольку: (i) при высокой скорости инфузии клетки имеют тенденцию выходить из каналов роста путем скольжения, и (ii) направление касательного вектора в основании различных клеток изменялось. несколько иное значение и явно отличалось от нуля (см. таблицу S1). Однако для опорной точки, как и для свободной точки, направление касательного вектора не может быть определено из предопределенных условий.Таким образом, мы решили отдельно для каждой ячейки уравнения упругости и использовали в качестве граничных условий подогнанные направления касательного вектора в основании и вершине конкретной ячейки, которые были извлечены специально написанной функцией Matlab (см. Раздел «Материалы и методы»). ). Фактически, клетка может претерпеть некоторое боковое смещение, если ростовой канал немного больше ее диаметра, как это всегда бывает. Однако этим смещением пренебрегли, поскольку оно намного меньше бокового смещения для.Чтобы вычислить планку погрешности каждого измерения, мы дважды повторили расчет жесткости при изгибе; один раз с базовым углом и углом при вершине равными их подогнанным значениям плюс ошибка посадки, а второй раз с углами основания и вершины равными их подогнанным значениям минус погрешность посадки (см. рисунок S4). В целом мы рассчитали жесткость на изгиб 31 ячейки при применяемой скорости инфузии. Из этих расчетов мы находим значение того же порядка, что и значение, которое было измерено Wang et al.[31]. Ошибка представляет собой стандартное отклонение значений различных ячеек (см. Таблицу S1).

Деформация растущих клеток

(i) Профиль деформации аналогичен профилю, наблюдаемому для нерастущих клеток. Далее мы исследовали процесс деформации растущих клеток. Пример деформации отдельной ячейки под действием потока показан на рисунке 2 (B). По мере того, как клетка вырастала из канала роста, она испытывала возрастающую силу. Первоначально он выдерживал силу и рос как прямая нить.Однако, когда он достиг длины примерно, сила стала слишком большой, чтобы выдержать, и он начал деформироваться. По мере роста ячейки угол деформации увеличивался. Наконец, в основном русле он вырос горизонтально. Обратите внимание, что режим деформации растущей клетки похож на режим деформации нерастущих клеток. Таким образом, глядя только на состояние клетки в один момент времени (см., Например, рисунок 2 (b), панель 4) и без предварительного знания истории клетки или состояния роста, очень трудно определить простым способом, если это является ли конкретная клетка растущей или нет.Однако в этом случае нельзя сделать вывод о жесткости ячеек на изгиб путем расчета, аналогичного тому, который был проведен для нерастущих ячеек, поскольку ячейки синтезируют и разрушают свою оболочку в процессе деформации.

Следует отметить, что, как и в случае с нерастущими клетками, для растущих клеток также наблюдалась определенная межклеточная изменчивость в поведении (см. Рисунок S5). Это поведение дополнительно подтверждает наш вывод о том, что может существовать некоторая межклеточная изменчивость механических свойств оболочки клеток.

(ii) Растущие клетки не расслабляются полностью после снятия силы. Чтобы подчеркнуть разницу в процессе деформации растущих и нерастущих клеток, мы исследовали релаксацию растущих клеток при остановке инфузии. Пример поведения растущей клетки, когда поток деформации уменьшается с нуля, показан на рисунке 3 (B). Сразу после остановки потока (панель (2) рисунка) уменьшились размеры и ячейка стала менее изогнутой. Тем не менее, вместо того, чтобы расслабиться до прямой конфигурации как нерастущая клетка, она продолжала расти по кривой.Такое поведение показывает, что деформация растущей клетки является результатом двух взаимодополняющих механизмов: упругой деформации из-за мгновенно действующей силы и постоянной пластической деформации клеточной структуры в результате сил, которые действовали на нее в прошлом. Следует отметить, что это описание не противоречит предыдущим предположениям о том, что рост может приводить к генерации прямой конформации [19], [21], [22], [40]. В этих исследованиях механизмы, которые были предложены, действуют в более длительном временном масштабе, равном нескольким временам удвоения бактерий, тогда как здесь мы обсуждаем поведение в гораздо более коротком временном масштабе минут (в нашем случае время удвоения равно минутам).

(iii) Сравнение деформации растущих и нерастущих клеток. Чтобы сравнить склонность растущих и нерастущих клеток к деформации под действием силы, мы проанализировали деформацию растущих клеток при различных значениях скорости инфузии (). Поскольку характер деформации растущих клеток можно разделить на две фазы, в одной из которых клетка прямая, а во второй — изгибается (см. Рисунок 2 и рисунок S5), мы записали поведение нескольких клеток при каждой скорости инфузии и подобрали глобально для различные значения скорости инфузии () в процессе их роста до прямой.Из этих совпадений мы извлекли значение. Результаты показаны на рисунке 7, где полосы ошибок представляют стандартное отклонение значений, полученных из стандартного отклонения аппроксимации прямых линий. Как можно видеть, линейно увеличивается при низких значениях, а затем насыщается по мере увеличения скорости инфузии (и, следовательно, силы). Мы подогнали эту функцию к форме и нашли значения и.

эту функцию для находим. Сравнивая это значение с тем, которое было обнаружено для нерастущих клеток, мы заключаем, что сила, необходимая для деформации растущих клеток в той же степени, что и для нерастущих клеток, примерно в два раза меньше для низких значений силы ().

Обсуждение

Заимствованное из теории упругости и материаловедения, деформирование биологического материала в настоящее время является стандартным способом изучения его механических свойств. Например, жесткость при изгибе микротрубочек и клеток измеряли путем отклонения с помощью оптического пинцета [31], [41]. В частности, сила, возникающая в результате гидродинамического потока, ранее использовалась как с теоретической, так и с экспериментальной точки зрения для изучения упругих свойств [42], [43]. Мы представили экспериментальную методику изучения латеральной деформации нитчатых клеток с использованием гидродинамических сил в микрофлюидном устройстве и продемонстрировали этот экспериментальный метод, изучая деформацию растущих и нерастущих нитчатых клеток E.coli клеток. Этот подход несколько отличается от предыдущих измерений, поскольку, в отличие от обычных материалов, растущие клетки могут деформировать свою оболочку. Наше исследование привело к трем выводам:

(i) Мы использовали наше устройство для расчета жесткости при изгибе нерастущих клеток E. coli и обнаружили, что это так. Следует отметить, что Wang et al. рассчитали значение для жесткости при изгибе нативных клеток E. coli и значение для клеток E. coli, обработанных MreB [44].Скорее всего, немного большее значение жесткости при изгибе, которое было рассчитано нами для нативных клеток E. coli , является результатом либо того факта, что нерастущие клетки не были идеально прямыми до приложения силы, либо небольшого перегиба. оценка силы, действующей на клетки из-за их тенденции к выходу из фокуса. Тем не менее, наш расчет служит дополнительным доказательством порядка величины упругой силы грамотрицательных бактериальных клеток.

(ii) По нашим оценкам, в нашей установке из-за пластической реакции растущих клеток сила, необходимая для деформации нерастущих клеток, была примерно в два раза больше, чем сила, необходимая для деформации растущих клеток в такой же степени. при низких значениях силы, т.е.е. когда угол деформации нерастущих ячеек близок к нулю. Мы хотели бы подчеркнуть, что как растущие, так и нерастущие клетки минимизировали свою механическую энергию, выравниваясь с полем потока. Разница между ними в том, что растущая клетка может реконструировать свою оболочку в соответствии с полем напряжения, которое она испытывает в процессе своего роста. Таким образом, помимо эластичного ответа, растущие клетки обладают способностью пластически необратимо деформироваться. Благодаря этому механизму ячейка может снизить затраты механической энергии, связанные с ее деформацией.На практике это приводило к большему углу деформации растущих ячеек по сравнению со случаем нерастущих ячеек при той же силе, когда сила была мала. В соответствии с этой идеей мы показали, что нерастущие клетки расслабляются до своей исходной конформации после того, как сила была снята, тогда как растущие клетки не расслаблялись до прямой конформации, если сила постоянно воздействовала на них во время их роста. Следовательно, в то время как нерастущие клетки вели себя как растянутая пружина, которая высвобождала свою механическую энергию, когда сила была снята, растущие клетки вели себя как комбинация растянутой пружины и изначально изогнутого стержня, который не имел затрат механической энергии для их изогнутой формы .Эти измерения являются одними из первых, кто оценивает этот эффект количественно.

Следует отметить, что частично различие между деформационным поведением растущих и нерастущих клеток может быть связано с разницей в осмоляльности между LB-буфером, который использовался во время деформации растущих клеток (), и буфером A ( ), который использовался при деформации нерастущих клеток. Однако ингибирование роста либо азидом натрия, либо рифампицином в LB показало количественно такую ​​же картину (данные не показаны).Поэтому мы полагаем, что большая часть эффекта является результатом взаимодействия между эластичностью и пластичностью, а не разницы в осмолярности. Действительно, мы наблюдали усиление жесткости клеток, когда для подавления роста использовалась чистая вода, но влияние осмотического давления на механику нерастущих клеток оставлено для будущих экспериментов.

(iii) мы заметили некоторые вариации склонности к деформации от клетки к клетке. В течение последнего десятилетия было показано, что бактериальные клетки обладают множеством систем с большой межклеточной гетерогенностью, такими как антигены клеточной поверхности, которые они экспрессируют, или их хемотаксическое плавательное поведение [45].Было высказано предположение, что они использовали эту межклеточную гетерогенность в качестве стратегии выживания. Недавно Fantner et al. измерили активность антимикробного пептида на отдельных клетках и обнаружили большую неоднородность в динамике индуцированной гибели бактериальных клеток [29]. Аналогичным образом Yao et al. наблюдали три различных способа образования выпуклостей для разных клеток в пределах изогенной популяции E. coli после обработки клеток цефалексином [46]. Наиболее вероятно, что эти неоднородности были результатом различий внутри клеточных стенок, соединения клеточных стенок с внешней мембраной или соединения клеточных стенок с цитоскелетом отдельной бактерии.Обратите внимание, что стандартное отклонение от среднего значения жесткости на изгиб, которое было измерено Wang et al. () также была довольно большой [44]. Наши результаты, хотя и только предварительные, подтверждают такой вывод о том, что отдельные клетки различаются по структуре их оболочки, и мотивируют будущие эксперименты по индивидуальности бактерий в отношении их механической прочности. Такие исследования могут пролить дополнительный свет на способность отдельных клеток адаптироваться к окружающей среде или противостоять лечению антибиотиками.

Наконец, мы хотим упомянуть, что экспериментальный метод, представленный здесь, может быть использован в будущем для понимания механики других бациллярных бактерий, таких как грамположительные и кислотоустойчивые (т.е. микобактерии с особенно толстым слоем клеточной стенки). Его также можно использовать для понимания механических эффектов лекарств или мутаций, нарушающих синтез клеточной стенки или сборку цитоскелета. В своем всестороннем обзоре формы бактерий Кевин Янг писал: «Что нам нужно … нам нужно иметь возможность манипулировать формой помимо других биохимических изменений» [47]. Представленные здесь устройство и результаты — это один из ответов на призыв Янга.

Примечание вставлено во время проверки: после отправки этой статьи мы узнали о двух экспериментах, подобных нашему.Во-первых, Nezhad et al. использовали поток в микрофлюидном устройстве для измерения модуля Юнга пыльцевого зерна [48]. Во-вторых, Амир и др. использовали, по сути, ту же установку, чтобы показать, что клетки E. coli отклоняются либо упруго, либо пластически в зависимости от продолжительности приложенной силы [49].

Материалы и методы

Бактериальный штамм

Мы использовали штамм E. coli SJ152, полученный из малоподвижного штамма MG1655 # 6300 [50]. Штамм трансдуцировали с помощью intC :: lambdaPR-YFP для постоянной экспрессии YFP [51], а затем трансформировали плазмидой pDB192 [52], содержащей SOS-белок SulA под промотором Plac.

Условия роста и микроскопия

Все эксперименты проводились при 30 ° C. Клетки выращивали в пробирках (3 мл в 14 мл пробирке) в бульоне LB (10,0 г триптона, 5,0 г дрожжевого экстракта, 10,0 г NaCl на 1 л) + 100 ампициллина (Sigma-Aldrich A9518) до OD 600 0,2. –1,1 на шейкере (240 об / мин). Когда была достигнута желаемая OD, клетки концентрировали до OD 600, вводили в микрофлюидное устройство и инкубировали до тех пор, пока не заселялось достаточное количество каналов роста.Затем его промывали предварительно нагретым LB, чтобы удалить остаточные бактерии из основных каналов.

Микроскопические эксперименты проводились с использованием микроскопа Nikon eclipse Ti, оборудованного инкубатором с постоянной температурой (In Vivo Scientific) и источником света Nikon Intensilight. Изображения были получены с использованием объектива Nikon 100x PlanApo 1.4 NA и охлаждаемой CCD-камеры CoolSNAPHQ (Photometrics). Изображения были загружены в компьютер с помощью программы Nikon NIS-Elements. Насосы PHD и насос 33 Гарвардского аппарата, работающие с использованием специализированных программ LabView, использовали для вливания среды с различной скоростью, как указано.Устройство помещали под микроскоп и использовали бульон LB + 150 IPTG (Goldbio.com I2481C5) с 0,1 мг / мл BSA или без него для индукции филаментации. Покадровую флуоресцентную микроскопию в сочетании с получением Z-стека (3 цифры, разделенные по 2 каждая) использовали для регистрации формы клеток как функции времени. Во время эксперимента через определенные промежутки времени записывались изображения в ярком поле, чтобы определить расположение каналов роста.

Деформацию нерастущих клеток изучали в буфере A, в котором отсутствует какой-либо источник углерода и который содержит: 1x соли M9 (BD Difco 248510), 0.5–1 азид натрия (ACROS 26628-22-8) и 150 IPTG. Быстрая замена буфера с минимальным приложением силы во время замены была достигнута путем остановки инфузии бульона LB и вливания буфера A на 10 минут с импульсами в секунду, с последующей той же процедурой в течение 5 минут и, наконец, промыванием в течение половины час. Во время фазы замены буфера направление потока во впускном отверстии для бульона LB было обратным, так что он служил вторым выпускным отверстием.

Анализ изображения

изображений были открыты с помощью плагина BioFormats для ImageJ (Rasband WS (1997-2012) ImageJ.Бетесда, Мэриленд, США: Национальный институт здоровья. URL http://imagej.nih.gov/ij/.). Границы ячеек были извлечены с помощью плагина MultiThresholder с использованием методов Renyi Entropy или Li. Пользовательский код, написанный в Matlab (MATLAB (2011) версия 7.13.0 (R2011b). Натик, Массачусетс: MathWorks Inc.), использовался для нахождения средней линии каждой ячейки в каждый момент времени путем рассечения границы ячейки. на две и вычисляя среднее положение двух половин [54]. Следуя Wiggins et al.[55] точки распределялись через каждые 0,5 по средней линии. Для нерастущих клеток использовался специальный код, написанный в Matlab, чтобы рассчитать жесткость на изгиб по профилю, как подробно описано в тексте S2. Все графики были подготовлены с использованием IgorPro (IgorPro (2009), версия 6.1.2.1. Lake Oswego, OR, США: WaveMetrics, Inc.).

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Схема микрофлюидного устройства, которое использовалось для измерений. Устройство состояло из двух входов и одного выхода, которые были объединены в два параллельных основных микрофлюидных канала.С каждой стороны двух основных каналов были подключены по 2000 тупиковых каналов роста меньшего размера. Нитчатые клетки сначала росли внутри каналов роста, пока не проникли в основные каналы, где они испытывали гидродинамическую силу, возникающую в результате потока.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083775.s001

(TIF)

Рисунок S3.

Пример нерастущей клетки, деформирующейся под действием возрастающей силы. После каждого случая инфузия в основном канале сводилась к минимуму, и клетке давали возможность восстановиться до ее неповрежденной конформации.Панель 1 без изменений; панели 2-6, силы соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083775.s003

(TIF)

Рисунок S4.

Пример анализа деформации нерастущей клетки. (a) положение средней линии для нерастущей клетки до (серый) и после (черный) приложения силы (скорость инфузии). Прямая серая линия обозначает конец канала роста. (б) Результаты пользовательского кода, написанного в Matlab для анализа деформации.Черная линия — конформация части ячейки из (а) в основном канале в приведенных координатах, для которой общая длина дуги ячейки равна. Темно-серая линия — конформация клетки, выведенная из уравнений упругости, для которых угол при основании и угол при вершине равны углам анализируемой клетки. Светло-серые линии — такие же, как темно-серая линия с углом у основания и углом у кончика, равным подобранным значениям плюс и минус погрешность посадки соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083775.s004

(TIF)

Рисунок S6.

Профиль скорости в основном канале. (а) Пример профиля скорости в основных каналах. Скорость инфузии была. Разные цвета представляют измерения профиля скорости с левой и правой сторон двух основных каналов. Для каждой позиции рядом с каналами роста наблюдалась короткая пограничная зона, где скорость уменьшалась. Далее от каналов роста наблюдалось плато значения скорости.(б) Скорость превышает максимальную скорость на этой высоте. Теоретическое значение черной кривой. Серая кривая, усредненная по четырем кривым из (а).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083775.s006

(TIF)

Рисунок S7.

Скорость потока как функция скорости инфузии. Измеренная скорость плато шариков как функция скорости инфузии. Синие кружки и красные треугольники представляют результаты двух разных экспериментов. Для сравнения показаны теоретические значения, основанные на измеренных размерах основных каналов и в предположении однородного профиля потока (зеленые точки).Теоретическое значение больше измеренного, что согласуется с неоднородным профилем потока внутри основного канала.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083775.s007

(TIF)

Рисунок S8.

Теоретический профиль потока в устройстве на основе Gondret et al. [ 39 ] . (A) Прогнозируемый нормализованный профиль потока в закрытом воздуховоде с поперечным сечением. Скорости нормированы на максимальную скорость в центре канала.(B) Прогнозируемый нормализованный профиль потока в закрытом канале с указанными выше размерами в относительной части канала, которую может занимать клетка E. coli в нашем эксперименте. Скорости нормированы на максимальную скорость в центре канала. (C) Прогнозируемые скорости потока по скорости в той же точке на высоте относительной части канала, которую может занимать клетка E. coli в нашем эксперименте. Базовая линия была выбрана равной половине диаметра ячеек, что дает оценку скорости продольного сегмента E.coli относительно измеренной нами скорости.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083775.s008

(png)

Благодарности

Авторы благодарят Дебу Райчаудхури и Джона Бечхофера за критическое прочтение этой рукописи, Дебу Райчаудхури за плазмиду SulA и Сакджуна Джун за предоставление условий для проведения этого исследования и за критическое прочтение рукописи. Наконец, авторы хотели бы поблагодарить анонимного рецензента за критическую рецензию этой рукописи.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: YC. Проведены эксперименты: YC. Проанализированы данные: YC. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: YC. Написал статью: YC.

Ссылки

  1. 1. Höltje JV (1998) Рост несущего стресс и сохраняющего форму саккулюса муреина Escherichia coli. Microbiol Mol Biol Rev 62: 181–203.
  2. 2. Воллмер В., Блано Д., де Педро М.А. (2008) Структура и архитектура пептидогликанов.FEMS Microbiol Rev 32: 149–167.
  3. 3. Карбаллидо-Лопес Р. (2006) Актиноподобный цитоскелет бактерий. Microbiol Mol Biol Rev 70: 888–909.
  4. 4. Cabeen MT, Jacobs-Wagner C (2007) Кожа и кости: бактериальный цитоскелет, клеточная стенка и клеточный морфогенез. J Cell Biol 179: 381–387.
  5. 5. Deng Y, Sun M, Shaevitz JW (2011) Прямое измерение жесткости напряжения клеточной стенки и тургорного давления в живых бактериальных клетках. Phys Rev Lett 107: 158101.
  6. 6. Pilizota T, Shaevitz JW (2012) Быстрая многофазная объемная адаптация к гиперосмотическому шоку со стороны Escherichia coli. PLoS ONE 7: e35205.
  7. 7. Арнольди М., Фриц М., Бойерлейн Э., Радмахер М., Сакманн Э. и др. (2000) Бактериальное тургорное давление можно измерить с помощью атомно-силовой микроскопии. Phys Rev E Stat Phys Plasmas Fluids Relat Interdiscip Topics 62: 1034–1044.
  8. 8. Yao X, Jericho M, Pink D, Beveridge T (1999) Толщина и эластичность грамотрицательных саккулей муреина, измеренная с помощью атомно-силовой микроскопии.J Bacteriol 181: 6865–6875.
  9. 9. Дюфрен Ю.Ф. (2004) Использование нанотехнологий для исследования микробных поверхностей. Nat Rev Microbiol 2: 451–460.
  10. 10. Gaboriaud F, Dufrêne YF (2007) Атомно-силовая микроскопия микробных клеток: приложение к наномеханическим свойствам, поверхностным силам и силам распознавания молекул. Коллоиды Surf B Биоинтерфейсы 54: 10–19.
  11. 11. Dupres V, Alsteens D, Andre G, Dufrêne YF (2010) Микробная наноскопия: более пристальный взгляд на поверхности микробных клеток.Тенденции в микробиологии 18: 397–405.
  12. 12. Chen YY, Wu CC, Hsu JL, Peng HL, Chang HY и др. (2009) Изменение поверхностной жесткости Escherichia coli после инфицирования нитчатым бактериофагом. Langmuir 25: 4607–4614.
  13. 13. Vadillo-Rodriguez V, Beveridge TJ, Dutcher JR (2008) Поверхностная вязкоупругость отдельных грамотрицательных бактериальных клеток, измеренная с помощью атомно-силовой микроскопии. J Bacteriol 190: 4225–4232.
  14. 14. Vadillo-Rodriguez V (2009) Schooling SR, Dutcher JR (2009) Характеристика in situ различий в вязкоупругом ответе отдельных грамотрицательных и грамположительных бактериальных клеток.J Bacteriol 191: 5518–5525.
  15. 15. Кох А.Л. (1988) Биофизика бактериальных стенок, рассматриваемых как несущая напряжение ткань. Microbiol Rev 52: 337–353.
  16. 16. Марголин В. (2009) Создание бактериальной клетки. Curr Biol 19: R812 – R822.
  17. 17. Jiang H, Sun SX (2010) Морфология, рост и ограничение размера бактериальных клеток. Phys Rev Lett 105: 028101.
  18. 18. Ausmees N, Kuhn JR, Jacobs-Wagner C (2003) Бактериальный цитоскелет: промежуточная филаментоподобная функция в форме клетки.Ячейка 115: 705–713.
  19. 19. Кабин М.Т., Чарбон Дж., Воллмер В., Борн П., Осмис Н. и др. (2009) Кривизна бактериальных клеток посредством механического контроля роста клеток. EMBO J 28: 1208–1219.
  20. 20. Sycuro LK, Pincus Z, Gutierrez KD, Biboy J, Stern CA и др. (2010) Релаксация сшивания пептидогликанов способствует спиральной форме Helicobacter pylori и колонизации желудка. Ячейка 141: 822–833.
  21. 21. Mukhopadhyay R, Wingreen NS (2009) Определение кривизны и формы растущих бактерий.Phys Rev E: Stat, Nonlinear, Soft Matter Phys. 80: 062901.
  22. 22. Слюсаренко O, Cabeen MT, Wolgemuth CW, Jacobs-Wagner C, Emonet T (2010) Процессивность синтеза пептидогликана обеспечивает встроенный механизм устойчивости морфологии клеток с прямым стержнем. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 10086–10091.
  23. 23. Lan G, Wolgemuth CW, Sun SX (2007) Сила Z-кольца и форма клетки во время деления у палочковидных бактерий. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 16110–16115.
  24. 24.Jiang H, Si F, Margolin W, Sun SX (2011) Механический контроль формы бактериальных клеток. Biophys J 101: 327–335.
  25. 25. Домбровски С., Кан В., Моталеб М.А., Харон Н.В., Голдштейн Р.Э. и др. (2009) Эластичная основа формы Borrelia burgdorferi. Biophys J 96: 4409–4417.
  26. 26. Салливан С., Венкатараман С., Реттерер С., Эллисон Д., Доктич М. (2007) Сравнение вдавливания и эластичности E. coli и ее сферопластов с помощью АСМ. Ультрамикроскопия 107: 934 — 942.
  27. 27. Cerf A, Cau JC, Vieu C, Dague E (2009) Наномеханические свойства мертвых или живых бактерий с одним узором. Langmuir 25: 5731–5736.
  28. 28. Katan AJ, Dekker C (2011) Высокоскоростной АСМ показывает динамику отдельных биомолекул в нанометровом масштабе. Cell 147: 979–982.
  29. 29. Fantner GE, Barbero RJ, Gray DS, Belcher AM (2010) Кинетика антимикробной пептидной активности, измеренная на отдельных бактериальных клетках с использованием высокоскоростной атомно-силовой микроскопии.Nat Nanotechnol 5: 280–285.
  30. 30. Ямасита Х., Таока А., Учихаши Т, Асано Т, Андо Т и др. (2012) Визуализация одиночных молекул на поверхности живых бактериальных клеток с помощью высокоскоростной АСМ. J Mol Biol 422: 300–309.
  31. 31. Wang S, Arellano-Santoyo H, Combs PA, Shaevitz JW (2010) Актин-подобные филаменты цитоскелета вносят вклад в клеточную механику у бактерий. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 9182–9185.
  32. 32. Тусон Х. Х., Ауэр Г. К., Реннер Л. Д., Хасебе М., Тропини С. и др.(2012) Измерение жесткости бактериальных клеток по скорости роста в гидрогелях с регулируемой эластичностью. Mol Microbiol 84: 874–891.
  33. 33. Weibel DB, Diluzio WR, Whitesides GM (2007) Микротехнология встречает микробиологию. Nat Rev Microbiol 5: 209–218.
  34. 34. Микрожидкостный для клеточной биологии. сайт elveffow. URL-адрес: http://www.elveflow.com/microfluidic-reviews/review-microfluidic-for-cell-biology Дата обращения: 17 ноября 2013 г.
  35. 35. Huisman O, D’Ari R (1981) Механизм связывания индуцибельной репликации ДНК-деления клетки у E.coli. Природа 290: 797–799.
  36. 36. Mukherjee A, Cao C, Lutkenhaus J (1998) Ингибирование полимеризации FtsZ с помощью SulA, ингибитора септации в Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 2885–2890.
  37. 37. Дайкович А., Мукерджи А., Луткенхаус Дж. (2008) Исследование регулирования сборки FtsZ с помощью SulA и разработка модели полимеризации FtsZ. J Bacteriol 190: 2513–2526.
  38. 38. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. (1986) Теория упругости.Курс теоретической физики. Pergamon Press, 3-е издание.
  39. 39. Гондрет П., Ракотомалала Н., Рабо М., Салин Д., Ватцки П. (1997) Вязкие параллельные потоки в ячейке Хеле-Шоу с конечным соотношением сторон: аналитические и численные результаты. Phys Fluids 9: 1841–1843.
  40. 40. Takeuchi S, DiLuzio WR, Weibel DB, Whitesides GM (2005) Контроль формы нитчатых клеток Escherichia coli. Nano Lett 5: 1819–1823.
  41. 41. Felgner H, Frank R, Schliwa M (1996) Изгибная жесткость микротрубочек, измеренная с помощью оптического пинцета.J Cell Sci 109: 509–516.
  42. 42. Venier P, Maggs AC, Carlier MF, Pantaloni D (1994) Анализ жесткости микротрубочек с использованием гидродинамического потока и тепловых флуктуаций. Журнал биологической химии 269: 13353–13360.
  43. 43. Pozrikidis C (2011) Сдвиговое обтекание тонких эластичных стержней, прикрепленных к плоскости. Международный журнал твердых тел и структур 48: 137–143.
  44. 44. Ван П., Роберт Л., Пеллетье Дж., Данг В.Л., Таддей Ф. и др. (2010) Устойчивый рост кишечной палочки.Curr Biol 20: 1099–1103.
  45. 45. Эйвери С.В. (2006) Индивидуальность микробных клеток и основные источники неоднородности. Nat Rev Microbiol 4: 577–587.
  46. 46. Яо З., Кане Д., Кишони Р. (2012) Отчетливая морфологическая динамика отдельных клеток под действием бета-лактамных антибиотиков. Mol Cell 48: 705–712.
  47. 47. Молодой К.Д. (2006) Селективное значение формы бактерий. Microbiol Mol Biol Rev 70: 660–703.
  48. 48. Nezhad AS, Naghavi M, Packirisamy M, Bhat R, Geitmann A (2013) Количественная оценка модуля молодости первичной клеточной стенки растений с использованием Bending-Lab-On-Chip (BLOC).Лабораторный чип 13: 2599–2608.
  49. 49. Амир А., Бабайпур Ф., Нельсон Д. Р., Джун С. Упругие и пластические деформации стенок бактериальных клеток, arxiv: 1305.5843 [cond-mat.soft].
  50. 50. Barker CS, Prüss BM, Matsumura P (2004) Повышенная подвижность Escherichia coli путем интеграции элемента последовательности вставки в регуляторную область оперона flhD. J Bacteriol 186: 7529–7537.
  51. 51. Elowitz MB, Levine AJ, Siggia ED, Swain PS (2002) Стохастическая экспрессия гена в одной клетке.Наука 297: 1183–1186.
  52. 52. de Boer PA, Crossley RE, Rothfield LI (1990) Центральная роль продукта гена minC Escherichia coli в двух различных системах ингибирования клеточного деления. Proc Natl Acad Sci U S A 87: 1129–1133.
  53. 53. Lee JN, Park C, Whitesides GM (2003) Совместимость с растворителями микрофлюидных устройств на основе поли (диметилсилоксана). Anal Chem 75: 6544–6554.
  54. 54. Губерман Дж. М., Фэй А., Дворкин Дж., Вингрин Н. С., Гитаи З. (2008) Психиатр: шум и асимметрия в бактериальном делении, выявленные с помощью компьютерного анализа изображений при субпиксельном разрешении.PLoS Comput Biol 4: e1000233.
  55. 55. Виггинс П.А., ван дер Хейден Т., Морено-Эрреро Ф., Спаковиц А., Филлипс Р. и др. (2006) Высокая гибкость ДНК на коротких масштабах, исследованная с помощью атомно-силовой микроскопии. Nat Nanotechnol 1: 137–141.

Как и почему клетки растут как палочки | BMC Biology

  • 1.

    Campas O, Mahadevan L: Форма и динамика кончик-растущих клеток. Curr Biol. 2009, 19: 2102-2107. 10.1016 / j.cub.2009.10.075.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 2.

    Furchtgott L, Wingreen NS, Huang KC: Механизмы поддержания формы клеток у палочковидных грамотрицательных бактерий. Mol Microbiol. 2011, 81: 340-353. 10.1111 / j.1365-2958.2011.07616.x.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 3.

    Бернал Р., Рохас Э. Р., Дюмэ Дж .: Механика морфогенеза роста кончика кончика: что мы узнали из резиновых шариков. J Mech Mater Struct. 2007, 2: 1157-1168. 10.2140 / jomms.2007.2.1157.

    Артикул Google Scholar

  • 4.

    Де Педро М.А., Шварц Х., Кох А.Л.: Пятнистость введения муреина в боковую стенку Escherichia coli . Microbiology 2003, 149: 1753–1761.,

  • 5.

    Дэниэл Р.А., Эррингтон Дж .: Контроль клеточного морфогенеза у бактерий: два различных способа создания палочковидных клеток. Клетка. 2003, 113: 767-776. 10.1016 / S0092-8674 (03) 00421-5.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 6.

    Митчисон Дж. М., медсестра П.: Рост длины клеток у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe . J Cell Sci 1985, 75: 357–376.,

  • 7.

    Rojas ER, Hotton S, Dumais J: Химически опосредованное механическое расширение клеточной стенки пыльцевой трубки. Biophys J. 2011, 101: 1844-1853. 10.1016 / j.bpj.2011.08.016.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 8.

    Браун П.Дж., де Педро М.А., Кисела Д.Т., Ван дер Хенст С., Ким Дж., Де Болле Х, Фукуа С., Брун Ю.В.: Полярный рост в отряде Alphaproteobacterial Rhizobiales.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2012, 109: 1697-1701. 10.1073 / pnas.1114476109.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 9.

    Letek M, Fiuza M, Ordonez E, Villadangos AF, Ramos A, Mateos LM, Gil JA: Рост клеток и деление клеток в палочковидном актиномицете Corynebacterium glutamicum . Антони Ван Левенгук 2008, 94: 99–109.,

  • 10.

    Рохас Э., Териот Дж. А., Хуанг К. К.: Ответ скорости роста Escherichia coli на осмотический шок. Proc Natl Acad Sci U S A 2014, 111: 7807–7812.,

  • 11.

    Яо X, Джерико М., Пинк Д., Беверидж Т.: Толщина и эластичность грамотрицательных саккулов муреина, измеренная с помощью атомно-силовой микроскопии. J Bacteriol. 1999, 181: 6865-6875.

    CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

  • 12.

    Gan L, Chen S, Jensen GJ: Молекулярная организация грамотрицательного пептидогликана. Proc Natl Acad Sci U S A.2008, 105: 18953-18957. 10.1073 / pnas.0808035105.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 13.

    Deng Y, Sun M, Shaevitz JW: Прямое измерение жесткости клеточной стенки при напряжении и тургорного давления в живых бактериальных клетках. Phys Rev Lett. 2011, 107: 158101-10.1103 / PhysRevLett.107.158101.

    PubMed Статья Google Scholar

  • 14.

    Zhou X, Cegelski L: Зависящие от питательных веществ структурные изменения в пептидогликане S. aureus , выявленные методом твердотельной ЯМР-спектроскопии. Биохимия 2012, 51: 8143–8153.,

  • 15.

    Амир А., Нельсон Д.Р.: Дислокационный рост клеточных стенок бактерий. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2012, 109: 9833-9838. 10.1073 / pnas.1207105109.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 16.

    Дюмэ Дж .: Режимы деформации стенок ячеек. J Exp Bot. 2013, 64: 4681-4695. 10.1093 / jxb / ert268.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 17.

    Holtje JV: Рост несущего стресс и поддерживающего форму murein sacculus Escherichia coli . Microbiol Mol Biol Rev 1998, 62: 181–203.,

  • 18.

    Scheffers DJ, Pinho MG: Синтез стенок бактериальных клеток: новые выводы из исследований локализации.Microbiol Mol Biol Rev.2005, 69: 585-607. 10.1128 / MMBR.69.4.585-607.2005.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 19.

    Молодой К.Д .: Селективная ценность формы бактерий. Microbiol Mol Biol Rev.2006, 70: 660-703. 10.1128 / MMBR.00001-06.

    PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 20.

    Молодой К.Д .: Форма бактерий: двумерные вопросы и возможности.Annu Rev Microbiol. 2010, 64: 223-240. 10.1146 / annurev.micro.112408.134102.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 21.

    Sun SX, Jiang H: Физика бактериального морфогенеза. Microbiol Mol Biol Rev.2011, 75: 543-565. 10.1128 / MMBR.00006-11.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 22.

    Фиртель М., Хендерсон Г., Соколов И.: Нанохирургия: наблюдение цепей пептидогликана в стенках клеток Lactobacillus helveticus . Ультрамикроскопия 2004, 101: 105–109.,

  • 23.

    Gitai Z, Dye N, Shapiro L: Актин-подобный ген может определять полярность клеток у бактерий. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2004, 101: 8643-8648. 10.1073 / pnas.0402638101.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 24.

    Sv T, Wang S, Furchtgott L, Huang KC, Wingreen NS, Shaevitz JW, Gitai Z: бактериальный актин MreB вращается, и вращение зависит от сборки клеточной стенки. Proc Natl Acad Sci USA 2011, 108: 15822–15827.,

  • 25.

    Урселл Т.С., Нгуен Дж., Мондс Р.Д., Колавин А., Биллингс Дж., Узунов Н., Гитай З., Шаевиц Дж. В., Хуанг К.К .: Род форма бактерий поддерживается за счет обратной связи между кривизной клетки и локализацией цитоскелета. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2014, 111: E1025-E1034. 10.1073 / pnas.1317174111.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 26.

    Wang S, Furchtgott L, Huang KC, Shaevitz JW: Спиральное введение пептидогликана производит хиральное упорядочение стенки бактериальной клетки. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2012, 109: E595-E604. 10.1073 / pnas.1117132109.

    PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 27.

    Домингес-Эскобар Дж., Частанет А., Кревенна А.Х., Фромион В., Ведлих-Зольднер Р., Карбаллидо-Лопес Р.: Процессивное движение MreB-ассоциированных биосинтетических комплексов клеточной стенки у бактерий.Наука. 2011, 333: 225-228. 10.1126 / science.1203466.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 28.

    Гарнер ЕС, Бернард Р., Ван В., Чжуанг X, Руднер Д.З., Митчисон Т. Сопряженные круговые движения аппарата синтеза клеточной стенки и филаментов MreB в B. subtilis . Science 2011, 333: 222–225.,

  • 29.

    Круз Т., Борк-Йенсен Дж., Гердес К. Морфогенетические белки MreBCD Escherichia coli образуют важный мембраносвязанный комплекс. Mol Microbiol 2005, 55: 78–89.,

  • 30.

    Ван П., Роберт Л., Пеллетье Дж., Данг В.Л., Таддей Ф., Райт А., Джун С. Устойчивый рост Escherichia coli . Curr Biol 2010, 20: 1099–1103.,

  • 31.

    Belgrave AM, Wolgemuth CW: Эластичность и биохимия роста соотносят скорость репликации с длиной клеток и плотностью поперечных связей у палочковидных бактерий. Biophys J. 2013, 104: 2607-2611. 10.1016 / j.bpj.2013.04.028.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 32.

    Misra G, Rojas ER, Gopinathan A, Huang KC: Механические последствия обновления клеточной стенки при удлинении грамположительной бактерии. Biophys J. 2013, 104: 2342-2352. 10.1016 / j.bpj.2013.04.047.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 33.

    Цзян Х., Си Ф., Марголин В., Сан SX: Механический контроль формы бактериальных клеток. Biophys J. 2011, 101: 327-335. 10.1016 / j.bpj.2011.06.005.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 34.

    Jiang H, Sun SX: Морфология, рост и ограничение бактериальных клеток. Phys Rev Lett. 2010, 105: 028101-10.1103 / PhysRevLett.105.028101.

    PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 35.

    Kim JS, Sun SX: Морфология Caulobacter crescentus и механическая роль полумесяца. Biophys J 2009, 96: L47 – L49.,

  • 36.

    Jiang H, Sun SX: Рост изогнутых и спиральных бактериальных клеток.Мягкая материя. 2012, 8: 7446-7451. 10.1039 / c2sm25452b.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 37.

    Кох А.Л .: Теория поверхностного стресса микробного морфогенеза. Adv Microbial Physiol. 1983, 24: 301-366. 10.1016 / S0065-2911 (08) 60388-4.

    CAS Статья Google Scholar

  • 38.

    Drake T, Vavylonis D: Модель формы клеток делящихся дрожжей, управляемая мембраносвязанными факторами роста и цитоскелетом.PLoS Comput Biol. 2013, 9: e1003287-10.1371 / journal.pcbi.1003287.

    PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 39.

    Гориели А., Табор М.: Биомеханические модели роста гиф у актиномицетов. J Теорет биол. 2003, 222: 211-218. 10.1016 / S0022-5193 (03) 00029-8.

    Артикул Google Scholar

  • 40.

    Гориели А., Табор М.: Самоподобный рост кончика нитчатых организмов.Phys Rev Lett. 2003, 90: 108101-10.1103 / PhysRevLett.90.108101.

    PubMed Статья Google Scholar

  • 41.

    Campas O, Rojas E, Dumais J, Mahadevan L: Стратегии контроля формы клеток в клетках, растущих на кончике. Am J Bot. 2012, 99: 1577-1582. 10.3732 / ajb.1200087.

    PubMed Статья Google Scholar

  • 42.

    Cortes JC, Konomi M, Martins IM, Munoz J, Moreno MB, Osumi M, Duran A, Ribas JC: субъединица (1,3) бета-D-глюкансинтазы Bgs1p отвечает за делящиеся дрожжи формирование первичной перегородки.Mol Microbiol. 2007, 65: 201-217. 10.1111 / j.1365-2958.2007.05784.x.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 43.

    Ursell TS, Trepagnier EH, Huang KC, Theriot JA: Анализ экспрессии поверхностных белков выявляет характер роста грамотрицательной внешней мембраны. PLoS Comput Biol. 2012, 8: e1002680-10.1371 / journal.pcbi.1002680.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 44.

    Чанг Ф., Мартин С.Г. Формирование делящихся дрожжей с помощью микротрубочек. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2009, 1: a001347-10.1101 / cshperspect.a001347.

    PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 45.

    Перес П., Ринкон С.А.: Rho GTPases: регуляция полярности клеток и роста дрожжей. Biochem J. 2010, 426: 243-253. 10.1042 / BJ200

    .

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 46.

    Minc N, Boudaoud A, Chang F: Механические силы роста делящихся дрожжей. Curr Biol. 2009, 19: 1096-1101. 10.1016 / j.cub.2009.05.031.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 47.

    Schuster M, Treitschke S, Kilaru S, Molloy J, Harmer NJ, Steinberg G: Миозин-5, кинезин-1 и миозин-17 взаимодействуют при секреции грибковой хитинсинтазы. EMBO J. 2012, 31: 214-227. 10.1038 / emboj.2011.361.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 48.

    Taheri-Talesh N, Horio T, Araujo-Bazan L, Dou X, Espeso EA, Penalva MA, Osmani SA, Oakley BR: Аппарат для выращивания кончиков Aspergillus nidulans . Mol Biol Cell 2008, 19: 1439–1449.,

  • 49.

    Минк Н., Братман С.В., Басу Р., Чанг Ф .: Установление новых участков поляризации микротрубочками. Curr Biol. 2009, 19: 83-94. 10.1016 / j.cub.2008.12.008.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 50.

    Terenna CR, Makushok T, Velve-Casquillas G, Baigl D, Chen Y, Bornens M, Paoletti A, Piel M, Tran PT: Физические механизмы, перенаправляющие полярность и форму клеток у делящихся дрожжей. Curr Biol. 2008, 18: 1748-1753. 10.1016 / j.cub.2008.09.047.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 51.

    Bicho CC, Kelly DA, Snaith HA, Goryachev AB, Sawin KE: Каталитическая роль Mod5 в формировании ориентира полярности клеток Tea1.Curr Biol. 2010, 20: 1752-1757. 10.1016 / j.cub.2010.08.035.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 52.

    Das M, Drake T, Wiley DJ, Buchwald P, Vavylonis D, Verde F: Колебательная динамика Cdc42 GTPase в контроле поляризованного роста. Наука. 2012, 337: 239-243. 10.1126 / science.1218377.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 53.

    Kelly FD, медсестра P: Пространственный контроль активации Cdc42 определяет ширину клетки у делящихся дрожжей. Mol Biol Cell. 2011, 22: 3801-3811. 10.1091 / mbc.E11-01-0057.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 54.

    Кох А.Л .: Какого размера должна быть бактерия? Вопрос масштаба. Annu Rev Microbiol. 1996, 50: 317-348. 10.1146 / annurev.micro.50.1.317.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 55.

    Слюсаренко О., Хейнриц Дж., Эмонет Т., Якобс-Вагнер К.: Высокопроизводительный анализ субпиксельной точности бактериального морфогенеза и внутриклеточной пространственно-временной динамики. Mol Microbiol. 2011, 80: 612-627. 10.1111 / j.1365-2958.2011.07579.x.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 56.

    Guberman JM, Fay A, Dworkin J, Wingreen NS, Gitai Z: PSICIC: шум и асимметрия в бактериальном делении, выявленные с помощью компьютерного анализа изображений с субпиксельным разрешением.PLoS Comput Biol. 2008, 4: e1000233-10.1371 / journal.pcbi.1000233.

    PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 57.

    Green PB: Физика роста в Nitella : метод непрерывного анализа растяжимости in vivo на основе микроманометра для определения тургорного давления. Plant Physiol 1968, 43: 1169–1184.,

  • 58.

    Милани П., Брейбрук С.А., Будауд А: Уменьшение размера молотка: микромеханические подходы к морфогенезу.J Exp Bot. 2013, 64: 4651-4662. 10.1093 / jxb / ert169.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 59.

    Tuson HH, Auer GK, Renner LD, Hasebe M, Tropini C, Salick M, Crone WC, Gopinathan A, Huang KC, Weibel DB: Измерение жесткости бактериальных клеток по скорости роста в гидрогелях с регулируемой эластичностью . Mol Microbiol. 2012, 84: 874-891. 10.1111 / j.1365-2958.2012.08063.x.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 60.

    Whatmore AM, Reed RH: Определение тургорного давления у Bacillus subtilis : возможная роль K + в регуляции тургора. J Gen Microbiol 1990, 136: 2521–2526.,

  • 61.

    Cayley DS, Guttman HJ, Record MT Jr: Биофизическая характеристика изменений количества и активности Escherichia coli в клетках и внутриклеточных водах и тургорное давление в ответ на осмотический стресс. Biophys J 2000, 78: 1748–1764.,

  • 62.

    Тусон Х. Х., Реннер Л. Д., Вейбель Д.Б .: Полиакриламидные гидрогели как субстраты для изучения бактерий. Chem Commun. 2012, 48: 1595-1597. 10.1039 / c1cc14705f.

    CAS Статья Google Scholar

  • 63.

    Turner JJ, Ewald JC, Skotheim JM: Контроль размера клеток в дрожжах. Curr Biol. 2012, 22: R350-R359. 10.1016 / j.cub.2012.02.041.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 64.

    Чиен А.С., Хилл Н.С., Левин П.А.: Контроль размера клеток у бактерий. Curr Biol. 2012, 22: R340-R349. 10.1016 / j.cub.2012.02.032.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 65.

    Pan KZ, Saunders TE, Flor-Parra I, Howard M, Chang F: Кортикальная регуляция размера клеток с помощью измерителя cdr2p. eLife. 2014, 2014: e02040-10.7554 / eLife.02040.

    Google Scholar

  • 66.

    Bonazzi D, Julien JD, Romao M, Seddiki R, Piel M, Boudaoud A, Minc N: Нарушение симметрии при прорастании спор зависит от взаимодействия между стабильностью полярной шапки и механикой стенки спор. Dev Cell. 2014, 28: 534-546. 10.1016 / j.devcel.2014.01.023.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 67.

    Келли Ф.Д., медсестра P: De novo Формирование зоны роста из сферопластов делящихся дрожжей. PLoS One 2011, 6: e27977.,

  • 68.

    Lederberg J: Бактериальные протопласты, индуцированные пенициллином. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1956, 42: 574-577. 10.1073 / pnas.42.9.574.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 69.

    Ранджит Д.К., Янг К.Д.: стрессовая реакция Rcs и дополнительные белки оболочки необходимы для формирования формы клеток de novo у Escherichia coli . J Bacteriol 2013, 195: 2452–2462.,

  • 70.

    Kawai Y, Mercier R, Errington J: Морфогенез бактериальных клеток не требует существующей ранее матричной структуры. Curr Biol. 2014, 24: 863-867. 10.1016 / j.cub.2014.02.053.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 71.

    Mitchison JM: Рост одиночных клеток, I. Schizosaccharomyces pombe . Exp Cell Res 1957, 13: 244–262.,

  • 72.

    Kubitschek HE, Clay KB: вторая стадия роста для Schizosaccharomyces pombe . Exp Cell Res 1986, 165: 243–254.,

  • 73.

    Джонсон Б.Ф., Мията М., Мията Х .: Морфогенез делящихся дрожжей. Молекулярная биология делящихся дрожжей. Под редакцией: Насим А., Янг П., Джонсон Б.Ф. 1989, Academic Press, Нью-Йорк, 469331-469366.

    Google Scholar

  • 74.

    Lan G, Wolgemuth CW, Sun SX: сила Z-кольца и форма клеток во время деления у палочковидных бактерий.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007, 104: 16110-16115. 10.1073 / pnas.0702925104.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 75.

    Mata J, Nurse P: Tea1 и микротрубочковый цитоскелет важны для создания глобального пространственного порядка внутри клетки делящихся дрожжей. Клетка. 1997, 89: 939-949. 10.1016 / S0092-8674 (00) 80279-2.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 76.

    Тода Т., Умесоно К., Хирата А., Янагида М.: Чувствительные к холоду мутанты, останавливающие ядерное деление делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe . J Mol Biol 1983, 168: 251–270.,

  • 77.

    Piel M, Tran PT: Форма клеток и деление клеток у делящихся дрожжей. Curr Biol. 2009, 19: R823-R827. 10.1016 / j.cub.2009.08.012.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 78.

    Theriot JA: Чем бактерии отличаются от эукариот ?.BMC Biol. 2013, 11: 119-10.1186 / 1741-7007-11-119.

    PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 79.

    Sipiczki M: Расщепление перегородки делящихся дрожжей. FEMS Yeast Res. 2007, 7: 761-770. 10.1111 / j.1567-1364.2007.00266.x.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 80.

    Matias VR, Beveridge TJ: Крио-электронная микроскопия выявляет структуру нативной полимерной клеточной стенки в Bacillus subtilis 168 и существование периплазматического пространства. Mol Microbiol 2005, 56: 240–251.,

  • 81.

    Решес Г., Вануноу С., Фишов И., Фейнгольд М. Определение времени начала деления в E. coli : исследование на одной клетке. Phys Biol 2008, 5: 046001.,

  • 82.

    Hsin J, Gopinathan A, Huang KC: Нуклеотид-зависимые конформации димеров FtsZ и генерация сил, наблюдаемая с помощью моделирования молекулярной динамики. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2012, 109: 9432-9437. 10.1073 / pnas.1120761109.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 83.

    Li Y, Hsin J, Zhao L, Cheng Y, Shang W, Huang KC, Wang HW, Ye S: протофиламенты FtsZ используют механизм открывания петель для создания сжимающей силы. Science 2013, 341: 392–395.,

  • 84.

    Huang KC, Mukhopadhyay R, Wingreen NS: Опосредованный кривизной механизм локализации липидов на полюсах бактерий. PLoS Comput Biol. 2006, 2: e151-10.1371 / journal.pcbi.0020151.

    PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 85.

    Хуанг К.С., Меир Ю., Вингрин Н.С.: Динамические структуры в Escherichia coli : спонтанное образование колец MinE и полярных зон MinD. Proc Natl Acad Sci U S A 2003, 100: 12724–12728.,

  • 86.

    Shebelut CW, Guberman JM, van Teeffelen S, Yakhnina AA, Gitai Z: Caulobacter хромосомная сегрегация — это упорядоченный многоступенчатый процесс. Proc Natl Acad Sci USA 2010, 107: 14194–14198.,

  • 87.

    Chen YE, Tropini C, Jonas K, Tsokos CG, Huang KC, Laub MT: Пространственный градиент фосфорилирования белков лежит в основе репликативной асимметрии в бактерия.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2011, 108: 1052-1057. 10.1073 / pnas.1015397108.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 88.

    Лам Х., Матроул Дж. Я., Якобс-Вагнер К. Асимметричное пространственное распределение бактериальных белков передачи сигнала координирует события клеточного цикла. Dev Cell. 2003, 5: 149-159. 10.1016 / S1534-5807 (03) 00191-6.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 89.

    Дэвис Б.М., Уолдор М.К .: Установление полярной идентичности грамотрицательных палочек. Curr Opin Microbiol. 2013, 16: 752-759. 10.1016 / j.mib.2013.08.006.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 90.

    Thiem S, Kentner D, Sourjik V: Расположение хемосенсорных кластеров в E. coli и его связь с делением клеток. EMBO J 2007, 26: 1615–1623.,

  • 91.

    Mishra M, Huang Y, Srivastava P, Srinivasan R, Sevugan M, Shlomovitz R, Gov N, Rao M, Balasubramanian M: Цилиндрическая ячеистая геометрия обеспечивает точность размещения сайта деления у делящихся дрожжей.J Cell Sci. 2012, 125: 3850-3857. 10.1242 / jcs.103788.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 92.

    Марголин З .: ФцЗ и деление прокариотических клеток и органелл. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005, 6: 862-871. 10.1038 / nrm1745.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 93.

    Corbin BD, Yu XC, Margolin W: Исследование внутриклеточного пространства: функция системы Min в круглой форме Escherichia coli . EMBO J 2002, 21: 1998–2008.,

  • 94.

    Lundgren K, Walworth N, Booher R, Dembski M, Kirschner M, Beach D: mik1 и wee1 взаимодействуют в ингибирующем фосфорилировании тирозина cdc2. Клетка. 1991, 64: 1111-1122. 10.1016 / 0092-8674 (91)

    -2.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 95.

    Ptacin JL, Lee SF, Garner EC, Toro E, Eckart M, Comolli LR, Moerner WE, Shapiro L: веретенообразный аппарат направляет бактериальную сегрегацию хромосом.Nat Cell Biol. 2010, 12: 791-798. 10.1038 / ncb2083.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 96.

    Wu Y, Kaiser AD, Jiang Y, Alber MS: Периодическое изменение направления позволяет миксобактериям размножаться. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2009, 106: 1222-1227. 10.1073 / pnas.0811662106.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 97.

    Купер С., Денни М.В.: Гипотеза о взаимосвязи формы бактерий и подвижности у палочковидных бактерий. FEMS Microbiol Lett. 1997, 148: 227-231. 10.1111 / j.1574-6968.1997.tb10293.x.

    CAS Статья Google Scholar

  • 98.

    Kearns DB: Полевое руководство по подвижности роя бактерий. Nat Rev Microbiol. 2010, 8: 634-644. 10.1038 / nrmicro2405.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 99.

    Shapiro JA, Hsu C: Escherichia coli Взаимодействия клетки-клетки K-12, наблюдаемые с помощью покадровой видеозаписи. J Bacteriol 1989, 171: 5963–5974.,

  • 100.

    Rudge TJ, Steiner PJ, Phillips A, Haseloff J: Компьютерное моделирование синтетических микробных биопленок. ACS Synthetic Biol. 2012, 1: 345-352. 10.1021 / sb300031n.

    CAS Статья Google Scholar

  • 101.

    Ленски Р.Э., Травизано М: Динамика адаптации и диверсификации: эксперимент 10 000 поколений с бактериальными популяциями.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1994, 91: 6808-6814. 10.1073 / pnas.91.15.6808.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 102.

    Schaechter M, Maaloe O, Kjeldgaard NO: Зависимость от среды и температуры размера клеток и химического состава во время сбалансированного выращивания Salmonella typhimurium . J Gen Microbiol 1958, 19: 592–606.,

  • 103.

    Takeuchi S, DiLuzio WR, Weibel DB, Whitesides GM: Контроль формы нитчатых клеток Escherichia coli . Nano Lett 2005, 5: 1819–1823.,

  • 104.

    Tenaillon O, Rodriguez-Verdugo A, Gaut RL, McDonald P, Bennett AF, Long AD, Gaut BS: молекулярное разнообразие адаптивной конвергенции. Наука. 2012, 335: 457-461. 10.1126 / science.1212986.

    CAS PubMed Статья Google Scholar

  • 105.

    Domingue G, Costerton JW, Brown MR: Время удвоения бактерий модулирует эффекты опсонизации и доступного железа при взаимодействии между Staphylococcus aureus и нейтрофилами человека. FEMS Immunol Med Microbiol 1996, 16: 223–228.,

  • 106.

    Bochner BR: Глобальная фенотипическая характеристика бактерий. FEMS Microbiol Rev.2009, 33: 191-205. 10.1111 / j.1574-6976.2008.00149.x.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • 107.

    Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS: Полногеномный анализ трансляции in vivo с разрешением нуклеотидов с использованием профилирования рибосом.Наука. 2009, 324: 218-223. 10.1126 / science.1168978.

    CAS PubMed Central PubMed Статья Google Scholar

  • CDC — DPDx — Диагностические процедуры

    Schistosoma mansoni 140 мкм x 66 мкм. Диапазон 114-180 мкм x 45-73 мкм. Удлиненный, с выступающим боковым шипом около заднего конца. Передний конец заостренный и слегка изогнутый. Желтый или желто-коричневый. Зародыш. Содержит зрелый мирацидий. Боковой позвоночник. Найдено в кале; в редких случаях и в моче. Яйца выделяются нерегулярно и могут быть обнаружены не в каждом образце стула. Редко встречаются при хронических стадиях инфекции.
    Schistosoma japonicum 90 мкм x 70 мкм. Диапазон, 68-100 мкм x 45-80 мкм. Овал. Небольшой боковой шип часто виден или может выглядеть как небольшой крючок или «бугорок», расположенный в углублении в раковине. Желтый или желто-коричневый. Зародыш. Содержит зрелый мирацидий. Найдено в кале. Часто покрывается мусором и может не замечаться.
    Schistosoma haematobium 143 мкм x 60 мкм. Диапазон, 112-170 мкм x 40-70 мкм. Удлиненный, с закругленным передним концом и концевым шипом на заднем конце. Желтый или желто-коричневый. Зародыш. Содержит зрелый мирацидий. Терминальный отдел позвоночника.Обнаруживается в моче, иногда в кале. Яйцо часто покрыто мусором.
    Schistosoma intercalatum 175 мкм x 60 мкм. Диапазон 140-240 мкм x 50-85 мкм. Удлиненный, с сужающимся передним концом и концевым шипом. Иногда «веретенообразной». Желтый или желто-коричневый. Зародыш. Содержит зрелый мирацидий. Концевой шип длинный, тонкий, с загнутым концом. Напоминает яйцо S. haematobium , за исключением того, что оно длиннее, тоньше и длиннее корешок.Найдено в кале. Возможно, на корпусе есть обломки.
    Schistosoma mekongi 69 мкм x 56 мкм * Диапазон 51-73 мкм x 39-66 мкм. Сферический. Небольшой боковой шип, не всегда виден или может выглядеть как небольшая «бугорка» в углублении на раковине. Желтый или желто-коричневый. Зародыш. Содержит зрелый мирацидий. Найдено в кале. Очень похоже на яйцо S. japonicum , за исключением того, что оно меньше по размеру. Может быть покрыт мусором.
    Clonorchis sinensis 30 мкм x 16 мкм. Диапазон 27-35 мкм x 11-20 мкм. Маленькие, яйцевидные или продолговатые, с широким закругленным задним концом и выпуклой крышечкой, опирающейся на «плечи». На заднем конце можно увидеть небольшую «шишку». Желто-коричневый. Зародыш. Содержит зрелый мирацидий. Маленький размер, жаберная крышка и «выступ» на заднем конце. Раковина часто покрыта налипшим мусором.
    Описторхис spp. 30 мкм x 12 мкм. Диапазон, 26-30 мкм x 11-15 мкм. Удлиненный, с крышечкой на переднем конце и заостренной терминальной «бугоркой» на заднем конце. Желто-коричневый. Зародыш. Содержит зрелый мирацидий. Не имеет выступающих плеч, характерных для Clonorchis , и имеет более заостренный конец.
    Heterophyes heterophyes 28 мкм x 15 мкм. Диапазон, 28-30 мкм x 15-17 мкм. Маленький, удлиненный или слегка яйцевидный.Operculum. Незначительный «выступ» на заднем конце. Желто-коричневый. Зародыш. Содержит зрелый мирацидий. Напоминает яйцо Clonorchis , но с менее отчетливыми лопатками. Жаберная крышка шире, чем у Clonorchis .
    Metagonimus yokogawai 28 мкм x 17 мкм. Диапазон, 26-30 мкм x 15-20 мкм. Маленький, удлиненный или яйцевидный. Operculum. На переднем конце нет «плеч». Небольшая «бугорка», часто встречающаяся на заднем конце. Желтый или желто-коричневый. Зародыш. Содержит зрелый мирацидий. Напоминает яиц Clonorchis и Heterophyes . Оболочка немного тоньше, чем Heterophyes . Жаберная крышка шире Clonorchis .
    Paragonimus westermani 85 мкм x 53 мкм. Диапазон, 68-118 мкм x 39-67 мкм. Яйцевидной или удлиненной формы с толстой оболочкой. Жаберная крышка слегка приплюснута и входит в плечевую зону панциря.Задний конец утолщен. Яйцо часто несимметричное, с одной слегка приплюснутой стороной. От желто-коричневого до темно-коричневого. Без эмбриона. Наполнен желточным материалом, в который встроена зародышевая клетка. Клетки неправильного размера. Обнаруживается в мокроте, иногда в кале. Напоминает яйцо D. latum , но крупнее, немного асимметрично, а жаберная крышка меньше и более плоская. Самая широкая часть яйца Paragonimus обычно находится впереди центра; в D.latum , самая широкая область — вокруг центра.
    Fasciola hepatica 145 мкм x 80 мкм. Диапазон 120-150 мкм x 63-90 мкм. Эллипсоидальная тонкая оболочка. Жаберная крышка небольшая, нечеткая. От желтого до светло-коричневого. Без эмбриона. Заполнен желточными клетками, в которые встроена нечеткая зародышевая клетка. Большой размер. Яйца широкоовальные.
    Fasciolopsis buski 140 мкм x 80 мкм.Диапазон 130-159 мкм x 78-98 мкм. Эллипсоидальная тонкая оболочка. Жаберная крышка небольшая, нечеткая. Желто-коричневый. Без эмбриона. Заполнен желточными клетками, в которые встроена нечеткая зародышевая клетка. Большой размер. Напоминает яйцо F. hepatica и нелегко отличить от Fasciola .

    Гетерогенная абсорбция антимикробного пептида LL37 клетками Escherichia coli увеличивает выживаемость популяции

    Существенные изменения:

    1) У авторов может быть две возможности подкрепить свою позицию.Во-первых, в эксперименте, показанном на Рисунке 1, нельзя ли оценить количество клеток, чувствительных к каждому условию, и сопоставить это с наблюдаемым временем задержки? Это может быть сделано в Обсуждении после того, как будет задокументирован очевидный коллапс проницаемости.

    Наблюдаемая задержка роста клеток во времени связана с количеством нерастущих клеток, которое является функцией начальной концентрации AMP. Важно отметить, что наши эксперименты показывают, что иногда клетки делятся несколько раз, прежде чем перестают расти.Это затрудняет прямую связь количества нерастущих клеток с наблюдаемой временной задержкой. Наша математическая модель учитывает возможность того, что клетки перестают расти в разных поколениях, и использовалась для сравнения прогнозируемой задержки роста с экспериментальными измерениями (см. Рис. 4D). Предсказания нашей модели достаточно хорошо согласуются с экспериментальными результатами. Отклонения, вероятно, происходят из-за того, что времена удвоения клеток разбросаны (рис. 1D), в то время как наша модель предполагает фиксированное время удвоения клеток, равное 23 минутам.Из-за экспоненциального роста задержка роста очень чувствительна к времени удвоения клеток. Об этом прямо говорится в тексте (последний абзац подраздела «Математическая модель, основанная на абсорбции пептида, воспроизводит и объясняет экспериментальные наблюдения»).

    Еще один шаг, который должен быть осуществим, — это заставить клеточные популяции превратиться в несептирующиеся клеточные формы либо путем разумного использования антибиотика, индукции ингибитора фаговой септации, такого как лямбда-килограмм, либо с помощью мутантов с ts-септацией, сдвинутых на не- -допустимая температура.Тогда можно было бы ожидать, что не будет двух популяций флуоресцентно меченых клеток, и эффект инокулята, вероятно, исчезнет.

    Это стимулирующий комментарий, побудивший нас разработать новый эксперимент над рукописью. Мы добавили новый рисунок (рис. 5B) и изменили текст (последний абзац подраздела «Действие меченных красителем пептидов LL37 зависит от клеточного цикла и размера клетки») в связи с новыми данными. Комментарий правильно указывает, что несептирующиеся ячейки должны иметь более высокую устойчивость к AMP.Проблема с несептирующимися клетками состоит в том, что они нежизнеспособны, поскольку не делятся в дочерних клетках. Таким образом, трудно измерить какое-либо значение MIC, соответствующее несептируемым ячейкам.

    Вместо этого мы заставили клетки отложить деление, введя сублетальную дозу цефалексина (1 мкг / мл). При такой дозировке клетки, растущие в богатой ростовой среде (RDM), становятся длиннее без каких-либо заметных изменений в скорости роста или времени удвоения клеток. Об этом сообщили Fangwei Si, et al.(Current Biology 2017), и мы также подтвердили это в нашей лаборатории с помощью материнской машины микрофлюидики.

    Мы измерили MIC, используя 96-луночный планшет с размером инокулята 6,09 × 10 6 клеток / мл для клеток, растущих в RDM, и клеток, растущих в RDM + 1 мкг / мл цефалексина. Проведя три биологических повтора с в общей сложности 12 повторами для каждого условия, мы обнаружили, что отсроченное деление клеток с помощью цефалексина увеличивает MIC с 1,87 ± 0,23 мкМ до 2,09 ± 0,19 мкМ (рис. 5B).

    2) Рисунок 1 тоже следует улучшить. Рисунок 1E предполагает, что измеряется концентрация надосадочной жидкости LL37, меченного красителем. В тексте говорится о поглощении LL37 клеткой, поэтому колориметрические показания фракции супернатанта должны уменьшаться с увеличением размера посевного материала. Однако считывание в 1F поглощается LL37. Выводится ли это из вычитания финального сигнала LL37 из начального? Расчет должен быть четко определен, и должны быть предоставлены измерения флуоресценции как супернатанта, так и осадка.Теоретически флуоресценция осадка + супернатанта должна добавляться к исходной флуоресценции, если не происходит разложения.

    Рецензенты правы. Количество абсорбированных AMP определяется путем вычитания конечной концентрации AMP из начального значения. Мы изменили рисунок 1F, чтобы включить как оставшуюся концентрацию в супернатанте, так и предполагаемую поглощенную концентрацию. Соответствующим образом изменена и подпись:

    «Количество поглощенных клетками AMP определяется путем вычитания последних

    .

    (супернатант) от исходной концентрации AMP.”

    и обсудили это в тексте:

    «Мы наблюдали снижение концентрации AMP в супернатанте пропорционально размеру инокулята со средней скоростью 7,6 ± 2,1 × 10 8 AMP / клетка (рассчитано на основе линейной аппроксимации данных). Поскольку колориметрические измерения основаны на прозрачных растворах, нам пришлось вывести абсорбированные AMP, вычитая концентрацию надосадочной жидкости из начальной концентрации (рис. 1F, левая ось) ».

    Этот подход был использован, поскольку клетки (живые или мертвые) являются непрозрачными объектами, и их присутствие влияет на считывание сигнала флуоресценции, блокируя и рассеивая свет.Таким образом, калибровка метода и измерения проводились с прозрачными растворами.

    Из-за этого мы ограничены измерением концентрации AMP в супернатанте.

    3) У авторов есть еще одна возможность коррелировать связывание с мишенями в клетке. На фиг. 6 кинетика абсорбции LL37 энуклеированными миниклетками, отпочковывающимися из материнских клеток, была качественно сравнена с клетками с ДНК. График адсорбции в миниклетке представлен на 6В.Хотя удерживание кажется незатронутым, похоже, что скорость связывания в энуклеированной клетке медленнее. Если это так, то это следует рассмотреть в тексте, поскольку авторы пытаются оценить, какие молекулы-мишени в цитоплазме, а также наличие и отсутствие ДНК. Рисунок 6B может также включать сравнительный след кинетики адсорбции в соседних ядросодержащих клетках в качестве идеального контроля. Если бы скорость была ниже для меньших ячеек, это могло бы подтвердить выводы из 5А.

    Комментарий правильно указывает на то, что скорости адсорбции AMP на ядросодержащих и энуклеированных клетках различаются, даже несмотря на то, что удерживание качественно схоже.Для прямого сравнения мы добавили данные флуоресценции для ядерных соседних материнских клеток, а также добавили данные для другой мини-клетки на исправленном рисунке 6B. В отредактированной версии текста мы особо отметили, что:

    «Транслокация пептидов 5-FAM-LC-LL37 в мини-клетки показала качественно такое же поглощение и удерживание, как и в обычных клетках (рис. 6B), что предполагает наличие значительных взаимодействий AMP с внутриклеточным содержимым, отличным от ДНК.Тем не менее, скорость, с которой АМП абсорбируются мини-клетками, медленнее, чем в соседних материнских клетках с содержанием ДНК (рис. 6В), что, возможно, указывает на роль отрицательного заряда ДНК ».

    и в подписи к рисунку 6 мы упомянули:

    «Интенсивность флуоресценции на площади двух мини-клеток свидетельствует о значительном взаимодействии пептидов с энуклеированными мини-клетками. Скорость абсорбции AMP в мини-клетках ниже, чем в соседних материнских клетках, содержащих ДНК.”

    Мы считаем, что определение точной цели привязки AMP — сложная задача, выходящая за рамки данной работы. Причина разницы в скорости связывания между ядросодержащими и энуклеированными может быть больше, чем просто содержание ДНК. Содержание рибосом и протеом также могут играть важную роль, которую еще предстоит определить.

    4) Пожалуйста, обратите внимание на следующий момент в тексте рукописи: Основная проблема с этим исследованием заключается в очень незначительном влиянии размера посевного материала на MIC, a 1.5-кратное увеличение (рис. 1В). Принятая вариация в определении МПК — 2 раза. Конечно, можно выполнить более точное измерение MIC с множеством повторов и с небольшими приращениями увеличения противомикробного препарата, что авторы и делают в этом исследовании. Однако значение этого небольшого эффекта для биологии или клинических проявлений инфекции неясно.

    Диапазон MIC на рисунке 1B был очень узким, всего в 1,5 раза, потому что мы ограничили анализ разбавленными культурами, чтобы избежать каких-либо побочных эффектов культур стационарной фазы (самая высокая плотность клеток в схеме 96-луночного планшета на рисунке 1А равно 6.09 × 10 6 клеток / мл). Причина в том, что мы хотели получить представление о поведении отдельных клеток в популяции. Чтобы продемонстрировать важность эффекта посевного материала за пределами этого скромного диапазона, мы провели дополнительные анализы МИК для большего размера посевного материала, показав, что МИК может увеличиваться примерно на один порядок. В доработанном варианте текста сообщается, что:

    «Отдельная серия экспериментов с плотными культурами показала, что MIC увеличивается до (.𝟨𝟫 ± .𝟦𝟥) μ и (.± .𝟪𝟪) μ𝖬 для размеров посевного материала .𝟤 × 𝟣𝟢𝟨 и .𝟦 × 𝟣𝟢𝟨 клеток / мл (для каждого сообщенного значения использовали 8 повторов с 3 биологическими повторами).