Ифнс госпошлина: Государственная пошлина | ФНС России

Содержание

Государственная пошлина | ФНС России

Наименование доходов	Коды бюджетной классификации
Государственная пошлина за государственную регистрацию юридического лица, физических лиц в качестве индивидуальных предпринимателей, изменений, вносимых в учредительные документы юридического лица, за государственную регистрацию ликвидации юридического лица и другие юридически значимые действия (сумма платежа (перерасчеты, недоимка и задолженность по соответствующему платежу, в том числе по отмененному)	182 1 08 07010 01 1000 110
Государственная пошлина за государственную регистрацию юридического лица, физических лиц в качестве индивидуальных предпринимателей, изменений, вносимых в учредительные документы юридического лица, за государственную регистрацию ликвидации юридического лица и другие юридически значимые действия (при обращении через многофункциональные центры)	182 1 08 07010 01 8000 110
Государственная пошлина за право использования наименований «Россия», «Российская Федерация» и образованных на их основе слов и словосочетаний в наименованиях юридических лиц (сумма платежа (перерасчеты, недоимка и задолженность по соответствующему платежу, в том числе по отмененному)	182 1 08 07030 01 1000 110
Государственная пошлина за совершение действий, связанных с лицензированием, с проведением аттестации в случаях, если такая аттестация предусмотрена законодательством Российской Федерации, зачисляемая в федеральный бюджет (государственная пошлина за предоставление лицензии)	182 1 08 07081 01 0300 110
Государственная пошлина за совершение действий, связанных с лицензированием, с проведением аттестации в случаях, если такая аттестация предусмотрена законодательством Российской Федерации, зачисляемая в федеральный бюджет (государственная пошлина за переоформление документа, подтверждающего наличие лицензии, и (или) приложения к такому документу в связи с внесением дополнений в сведения об адресах мест осуществления лицензируемого вида деятельности, о выполняемых работах и об оказываемых услугах в составе лицензируемого вида деятельности, в том числе о реализуемых образовательных программах)	182 1 08 07081 01 0400 110
Государственная пошлина за совершение действий, связанных с лицензированием, с проведением аттестации в случаях, если такая аттестация предусмотрена законодательством Российской Федерации, зачисляемая в федеральный бюджет (государственная пошлина за переоформление документа, подтверждающего наличие лицензии, и (или) приложения к такому документу в других случаях)	182 1 08 07081 01 0500 110
Государственная пошлина за совершение действий, связанных с лицензированием, с проведением аттестации в случаях, если такая аттестация предусмотрена законодательством Российской Федерации, зачисляемая в федеральный бюджет (государственная пошлина за выдачу дубликата документа, подтверждающего наличие лицензии)	182 1 08 07081 01 0700 110
Прочие государственные пошлины за государственную регистрацию, а также за совершение прочих юридически значимых действий (государственная пошлина за совершение прочих юридически значимых действий)	182 1 08 07200 01 0039 110
Государственная пошлина за повторную выдачу свидетельства о постановке на учет в налоговом органе (сумма платежа (перерасчеты, недоимка и задолженность по соответствующему платежу, в том числе по отмененному)	182 1 08 07310 01 1000 110
Государственная пошлина за рассмотрение заявления о заключении соглашения о ценообразовании, заявления о внесении изменений в соглашение о ценообразовании (сумма платежа (перерасчеты, недоимка и задолженность по соответствующему платежу, в том числе по отмененному)	182 1 08 07320 01 1000 110
Государственная пошлина за повторную выдачу свидетельства о постановке на учет в налоговом органе (при обращении через многофункциональные центры)	182 1 08 07310 01 8000 110
Государственная пошлина за государственную регистрацию юридического лица, физических лиц в качестве индивидуальных предпринимателей, изменений, вносимых в учредительные документы юридического лица, за государственную регистрацию ликвидации юридического лица и другие юридически значимые действия (при обращении в электронной форме и выдаче через многофункциональные центры)	182 1 08 07010 01 8001 110
Государственная пошлина за повторную выдачу свидетельства о постановке на учет в налоговом органе (при обращении в электронной форме и выдаче через многофункциональные центры)	182 1 08 07310 01 8001 110
Плата за предоставление сведений и документов, содержащихся в Едином государственном реестре юридических лиц и в Едином государственном реестре индивидуальных предпринимателей (при обращении в электронной форме и выдаче через многофункциональные центры)	182 1 13 01020 01 8001 130
Плата за предоставление информации, содержащейся в государственном информационном ресурсе бухгалтерской (финансовой) отчетности (федеральные государственные органы, Банк России, органы управления государственными внебюджетными фондами Российской Федерации)	182 1 13 01600 01 6000 130
Государственная пошлина по делам, рассматриваемым в арбитражных судах (государственная пошлина, уплачиваемая при обращении в суды)	182 1 08 01000 01 1050 110
Государственная пошлина по делам, рассматриваемым в арбитражных судах (государственная пошлина, уплачиваемая на основании судебных актов по результатам рассмотрения дел по существу)	182 1 08 01000 01 1060 110
Государственная пошлина по делам, рассматриваемым Конституционным Судом Российской Федерации (государственная пошлина, уплачиваемая при обращении в суды)	182 1 08 02010 01 1050 110
Государственная пошлина по делам, рассматриваемым Конституционным Судом Российской Федерации (государственная пошлина, уплачиваемая на основании судебных актов по результатам рассмотрения дел по существу)	182 1 08 02010 01 1060 110
Государственная пошлина по делам, рассматриваемым конституционными (уставными) судами субъектов Российской Федерации (государственная пошлина, уплачиваемая при обращении в суды)	182 1 08 02020 01 1050 110
Государственная пошлина по делам, рассматриваемым конституционными (уставными) судами субъектов Российской Федерации (государственная пошлина, уплачиваемая на основании судебных актов по результатам рассмотрения дел по существу)	182 1 08 02020 01 1060 110
Государственная пошлина по делам, рассматриваемым в судах общей юрисдикции, мировыми судьями (за исключением Верховного Суда Российской Федерации) (государственная пошлина, уплачиваемая при обращении в суды)	182 1 08 03010 01 1050 110
Государственная пошлина по делам, рассматриваемым в судах общей юрисдикции, мировыми судьями (за исключением Верховного Суда Российской Федерации) (государственная пошлина, уплачиваемая на основании судебных актов по результатам рассмотрения дел по существу)	182 1 08 03010 01 1060 110
Государственная пошлина по делам, рассматриваемым Верховным Судом Российской Федерации (государственная пошлина, уплачиваемая при обращении в суды)	182 1 08 03020 01 1050 110
Государственная пошлина по делам, рассматриваемым Верховным Судом Российской Федерации (государственная пошлина, уплачиваемая на основании судебных актов по результатам рассмотрения дел по существу)	182 1 08 03020 01 1060 110

Реквизиты для оплаты госпошлины

yle=»width: 500. 75pt; border-image: none 100% / 1 / 0 stretch; padding: 0cm; height: 13pt; border-color: currentcolor black black; border-style: none solid solid; border-width: medium 1pt 1pt;» valign=»bottom»>

Государственная пошлина по делам, рассматриваемым в судах общей юрисдикции, мировыми судьями (за исключением Верховного Суда Российской Федерации) (сумма платежа)

yle=»width: 503.05pt; border-image: none 100% / 1 / 0 stretch; padding: 0cm 1.4pt; height: 34.45pt; border-color: currentcolor windowtext windowtext; border-style: none solid solid; border-width: medium 1pt 1pt;» valign=»bottom»>

yle=»width: 501.6pt; border-image: none 100% / 1 / 0 stretch; padding: 0cm 1.4pt; height: 13pt; border-color: currentcolor windowtext windowtext; border-style: none solid solid; border-width: medium 1pt 1pt;» valign=»bottom»>

yle=»width: 500.75pt; border-image: none 100% / 1 / 0 stretch; padding: 0cm; height: 13pt; border-color: currentcolor black black; border-style: none solid solid; border-width: medium 1pt 1pt;» valign=»bottom»>

yle=»width: 500.7pt; border-image: none 100% / 1 / 0 stretch; padding: 0cm; height: 13pt; border-color: currentcolor black black; border-style: none solid solid; border-width: medium 1pt 1pt;» valign=»bottom»>

Отменена госпошлина за регистрацию юрлиц при электронной подаче документов в ФНС

СОГЛАШЕНИЕ О ПРЕДОСТАВЛЕНИИ И ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПЕРСОНАЛЬНЫХ ДАННЫХ

Настоящее соглашение регламентирует отношения между АО «Аналитический центр» и физическим лицом (Пользователь) и вступает в силу с момента принятия Пользователем условий настоящего соглашения. При несогласии Пользователя с хотя бы одним из пунктов соглашения, Пользователь не имеет права дальнейшей регистрации. Продолжение процедуры регистрации говорит о полном и безоговорочном согласии с настоящим соглашением.

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Регистрация — процедура, в ходе которой Пользователь предоставляет достоверные данные о себе по утвержденной форме регистрации (регистрационная карта). Прохождение процедуры регистрации говорит о том, что Стороны полно и безоговорочно согласились с условиями настоящего соглашения.

Персональные данные Пользователя — данные, используемые для идентификации личности, добровольно указанные Пользователем при прохождении регистрации. Данные хранятся в базе данных на сервере АО «Аналитический центр» и подлежат использованию исключительно в соответствии с настоящим соглашением и законодательством РФ.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕРСОНАЛЬНЫХ ДАННЫХ

Мы используем персональные данные Пользователя только для тех целей, которые указываются при их сборе. Мы не используем персональные данные для других целей без согласия Пользователя. Мы можем использовать персональные данные Пользователя для следующих целей:

Для организации выдачи Пользователю электронной цифровой подписи в рамках сети Аккредитованных при Некоммерческой организации «Ассоциация Электронных Торговых Площадок» Удостоверяющих центров, а также ее обслуживания и оказания сопутствующих услуг;
Для обратной связи с Пользователем в целях предоставления услуги или информации, в том числе посредством рассылки рекламных, информационных и (или) иных материалов АО «Аналитический Центр» на указанную электронную почту. Отказаться от рассылки рекламных, информационных и (или) иных материалов АО «Аналитический Центр» можно нажав на соответствующую кнопку в нижнем колонтитуле любого письма в рамках такой рассылки;
Для ответов на запросы Пользователя в службу поддержки;
Для выполнения обязательств по договорам.

Для использования персональных данных для любой иной цели мы запрашиваем подтверждение Пользователя. Пользователь соглашается, что АО «Аналитический центр» оставляет за собой право использовать его персональные данные анонимно и в обобщенном виде для статистических целей.

ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ПОЛЬЗОВАТЕЛЯ ПО РЕГИСТРАЦИИ

Пользователь соглашается предоставить правдивую, точную и полную информацию о себе по вопросам, предлагаемым в регистрационной карте. Если Пользователь предоставляет неверную информацию, АО «Аналитический центр» имеет право приостановить либо отменить регистрацию.

ПРЕДОСТАВЛЕНИЕ ПЕРСОНАЛЬНЫХ ДАННЫХ ПОЛЬЗОВАТЕЛЯ ТРЕТЬИМ ЛИЦАМ

АО «Аналитический центр» не передает персональные данные третьим лицам для маркетинговых целей без разрешения Пользователя.

АО «Аналитический центр» может передавать персональные данные Пользователя компаниям, аффилированным по отношению к АО «Аналитический центр», для обработки и хранения. Пользователь соглашается с тем, что АО «Аналитический центр» передает персональные данные Пользователя уполномоченным организациям для создания и выдачи электронной подписи, выполнения требуемых услуг и операций.

АО «Аналитический центр» предоставляем третьим лицам объем персональных данных, необходимый для оказания требуемой услуги или транзакции. При необходимости АО «Аналитический центр» можем использовать персональные данные Пользователя для ответа на претензии, исковые заявления.

АО «Аналитический центр» можем собирать и, при необходимости, передавать уполномоченным органам имеющуюся в нашем распоряжении информацию для расследования, предотвращения и пресечения любых незаконных действий. АО «Аналитический центр» вправе раскрывать любые персональные данные по запросам правоохранительных органов, решению суда и в прочих случаях, предусмотренных законодательством РФ.

С целью предоставления дополнительной информации, оказания услуг, Пользователь можете быть направлен на другие ресурсы, содержащие информационные или функциональные ресурсы, предоставляемые третьими лицами.

Только в тех случаях, когда информация собирается от лица АО «Аналитический центр», использование данных Пользователя будет определяться политикой АО «Аналитический центр» в отношении конфиденциальности персональных данных. При предоставлении информации на других ресурсах будут использоваться политики в отношении конфиденциальности персональных данных, проводимые их владельцами.

АО «Аналитический центр» требует от своих партнеров использования политики в отношении конфиденциальности персональных данных, согласующихся с политикой АО «Аналитический центр».

БЕЗОПАСНОСТЬ ВАШИХ ПЕРСОНАЛЬНЫХ ДАННЫХ

АО «Аналитический центр» использует технологии безопасности, процедуры и организационные меры для защиты персональных данных Пользователя от несанкционированного доступа, использования или разглашения.

АО «Аналитический центр» стремится защитить персональные данные Пользователя, но не может гарантировать безопасность передаваемых данных.

АО «Аналитический центр» рекомендует принимать все меры по защите ваших персональных данных при работе в Интернете. Часто меняйте пароли, используйте сочетание букв и цифр при создании паролей и используйте защищенный браузер.

ХРАНЕНИЕ ДАННЫХ

АО «Аналитический центр» не хранит персональные данные Пользователя дольше, чем необходимо для целей их сбора, или чем требуется в соответствии с действующими законами или правилами.

Государственная регистрация юридических лиц, индивидуальных предпринимателей и фермерских хозяйств В избранное

I. В случае предоставления государственной услуги по государственной регистрации создаваемого юридического лица заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о государственной регистрации юридического лица при создании по форме №Р11001.
Решение о создании юридического лица в виде протокола, договора или иного документа в соответствии с законодательством РФ.
Учредительный документ юридического лица, за исключением случая, если юридическое лицо будет действовать на основании типового устава, предусмотренного подпунктом «е» пункта 1 статьи 5 Федерального закона от 08.08.2001 №129-ФЗ.
Выписка из реестра иностранных юридических лиц соответствующей страны происхождения или иное равное по юридической силе доказательство юридического статуса иностранного юридического лица — учредителя.
Договор с Международным олимпийским комитетом и (или) Международным паралимпийским комитетом или уполномоченными ими организациями — в случае использования олимпийской и (или) паралимпийской символики в наименовании юридического лица, его фирменном наименовании.
Документ, подтверждающий присвоение выпуску (выпускам) акций регистрационного номера.

Уведомление о переходе на упрощенную систему налогообложения (предоставляется по желанию заявителя).

II. В случае предоставления государственной услуги по внесению в ЕГРЮЛ записи о том, что юридическое лицо (юридические лица) находится (находятся) в процессе реорганизации, заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем уведомление о начале процедуры реорганизации по форме №Р12003.
Решение о реорганизации.

III. В случае предоставления государственной услуги по государственной регистрации юридического лица, создаваемого путем реорганизации (преобразования, слияния, разделения, выделения), заявитель в обязательном порядке представляет:

Заявление о государственной регистрации в связи с завершением реорганизации юридического лица (юридических лиц), по форме №Р12016.
Учредительный документ юридического лица, за исключением случая, если юридическое лицо будет действовать на основании типового устава, предусмотренного подпунктом «е» пункта 1 статьи 5 Федерального закона от 08.08.2001 №129-ФЗ.
Договор о слиянии — в случаях, предусмотренных федеральными законами.
Передаточный акт или разделительный баланс.
Договор с Международным олимпийским комитетом и (или) Международным паралимпийским комитетом или уполномоченными ими организациями — в случае использования олимпийской и (или) паралимпийской символики в наименовании юридического лица, его фирменном наименовании при государственной регистрации юридического лица, создаваемого путем реорганизации (преобразования, слияния, разделения, выделения).
Документ, подтверждающий присвоение выпуску или выпускам акций государственного регистрационного номера или идентификационного номера, в случае если юридическим лицом, создаваемым путем реорганизации, является акционерное общество.
Документ, подтверждающий внесение изменений в решение о выпуске облигаций или иных (за исключением акций) эмиссионных ценных бумаг в части замены эмитента, в случае если реорганизуемым юридическим лицом является эмитент указанных эмиссионных ценных бумаг и в результате реорганизации его деятельность прекращается или в результате его реорганизации в форме выделения обязательства по эмиссионным ценным бумагам передаются юридическому лицу, создаваемому путем такого выделения.

Заявитель вправе по собственной инициативе представить:

IV. В случае предоставления государственной услуги по государственной регистрации изменений, вносимых в учредительные документы юридического лица, заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о внесении изменений по форме №Р13014.
Решение о внесении изменений в учредительный документ юридического лица либо иное решение и (или) документы, являющиеся в соответствии с федеральным законом основанием для внесения данных изменений.
Изменения, внесенные в учредительный документ юридического лица, или учредительный документ юридического лица в новой редакции.
Документ, подтверждающий принятие Банком России решения о регистрации проспекта акций, если в учредительный документ юридического лица, являющегося непубличным акционерным обществом, внесены изменения о включении в его фирменное наименование указания на то, что оно является публичным.
Документ, подтверждающий принятие Банком России решения об освобождении юридического лица, являющегося публичным акционерным обществом, от обязанности раскрывать информацию, предусмотренную законодательством Российской Федерации о ценных бумагах, если в учредительный документ юридического лица, являющегося акционерным обществом, внесены изменения об исключении из его фирменного наименования указания на то, что оно является публичным.
Документ, подтверждающие наличие у юридического лица, либо лица, имеющего право без доверенности действовать от имени юридического лица, либо участника общества с ограниченной ответственностью, владеющего не менее чем пятьюдесятью процентами голосов от общего количества голосов участников данного общества, права пользования в отношении объекта недвижимости или его части, расположенных по адресу, относящемуся к месту нахождения, указанному в решении об изменении места нахождения юридического лица, — в случае изменения адреса юридического лица, при котором изменяется место нахождения юридического лица.
Договор с Международным олимпийским комитетом и (или) Международным паралимпийским комитетом или уполномоченными ими организациями — в случае использования олимпийской и (или) паралимпийской символики в наименовании юридического лица, его фирменном наименовании.
Решение об изменении места нахождения.
Документы, подтверждающие наличие права пользования в отношении объекта недвижимости или его части, расположенных по новому адресу юридического лица (в том числе, в случае изменения адреса юридического лица, при котором изменяется место нахождения юридического лица).

V. В случае предоставления государственной услуги по внесению в ЕГРЮЛ изменений, касающихся сведений о юридическом лице, но не связанных с внесением изменений в учредительные документы, заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о внесении изменений по форме №Р13014.
Документы, подтверждающие основание перехода доли или части доли, — в случае внесения в ЕГРЮЛ изменений, касающихся перехода доли или части доли в уставном капитале общества с ограниченной ответственностью.

VI. В случае предоставления государственной услуги по внесению в ЕГРЮЛ изменений при реорганизации юридического лица в форме присоединения к нему другого юридического лица заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о внесении записи о прекращении деятельности присоединенного юридического лица по форме №Р16003.
Договор о присоединении.

VII. В случае предоставления государственной услуги по внесению в ЕГРЮЛ изменений, касающихся сведений о том, что акционерное общество находится в процессе уменьшения уставного капитала, заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о внесении изменений в ЕГРЮЛ.
Решение об уменьшении уставного капитала.

VIII. В случае внесения в ЕГРЮЛ изменений о том, что юридическим лицом принято решение об изменении места нахождения, для предоставления государственной услуги в инспекцию по месту нахождения юридического лица представляются:

Подписанное заявителем уведомление о внесении изменений по форме №Р13014.
Решение об изменении места нахождения.

IX. В случае предоставления государственной услуги при принятии решения о ликвидации юридического заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем уведомление о принятии решения о ликвидации юридического лица по форме №Р15016.
Подписанное заявителем уведомление о формировании ликвидационной комиссии или о назначении ликвидатора.
Подписанное заявителем уведомление о составлении промежуточного ликвидационного баланса.*

*Уведомление о составлении промежуточного ликвидационного баланса не может быть представлено в регистрирующий орган ранее срока:

установленного для предъявления требований кредиторами;
вступления в законную силу решения суда или арбитражного суда по делу (иного судебного акта, которым завершается производство по делу), по которому судом или арбитражным судом было принято к производству исковое заявление, содержащее требования, предъявленные к юридическому лицу, находящемуся в процессе ликвидации;
окончания выездной налоговой проверки, оформления ее результатов (в том числе рассмотрения ее материалов) и вступления в силу итогового документа по результатам этой проверки в соответствии с законодательством Российской Федерации о налогах и сборах в случае проведения в отношении юридического лица, находящегося в процессе ликвидации, выездной налоговой проверки.

X. В случае ликвидации юридического лица в результате принятия решения о ликвидации учредителями юридического лица заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о государственной регистрации по форме №Р16001.
Ликвидационный баланс.

Заявитель вправе по собственной инициативе представить:

XI. В случае государственной регистрации при прекращении унитарного предприятия в связи с продажей или внесением его имущественного комплекса в уставный капитал акционерного общества, учреждения в связи с внесением его имущества в уставный капитал акционерного общества, унитарного предприятия или учреждения в связи с передачей имущественного комплекса унитарного предприятия или имущества учреждения в собственность государственной корпорации в качестве имущественного взноса Российской Федерации заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о внесении в ЕГРЮЛ записи о прекращении унитарного предприятия или учреждения по форме №Р16002.
Решение об условиях приватизации имущественного комплекса унитарного предприятия или решение органа государственной власти, на основании которого осуществлены внесение имущественного комплекса унитарного предприятия или имущества учреждения в уставный капитал акционерного общества либо передача указанных имущественного комплекса или имущества в собственность государственной корпорации в качестве имущественного взноса Российской Федерации.

Заявитель вправе по собственной инициативе представить:

Копия документа, подтверждающего государственную регистрацию перехода права собственности на имущественный комплекс унитарного предприятия или на имущество учреждения.

XII. В случае ликвидации юридического лица через процедуру банкротства заявитель в обязательном порядке представляет:

Государственная регистрация осуществляется без участия заявителя на основании определения арбитражного суда о завершении конкурсного производства, поступившего в регистрирующий орган из арбитражного суда путем направления указанного определения заказным письмом с уведомлением о вручении либо в электронной форме с использованием информационно‑телекоммуникационных сетей общего пользования, в том числе сети Интернет.

XIII. В случае предоставления государственной услуги по внесению в ЕГРЮЛ сведений о юридическом лице, зарегистрированном до вступления в силу Федерального закона от 08.08.2001 №129‑ФЗ:

Подписанное заявителем сообщение, содержащее сведения, предусмотренные подпунктами «а» — «д», «л» пункта 1 статьи 5 Федерального закона от 08.08.2001 №129‑ФЗ, по форме №17001.

XIV. В случае предоставления государственной услуги по государственной регистрации физического лица в качестве индивидуального предпринимателя заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о государственной регистрации по форме №Р21001.
Копия основного документа физического лица, удостоверяющего личность гражданина Российской Федерации на территории Российской Федерации (в случае если физическое лицо, регистрируемое в качестве индивидуального предпринимателя, является гражданином Российской Федерации).
Копия документа, установленного федеральным законом или признаваемого в соответствии с международным договором Российской Федерации в качестве документа, удостоверяющего личность иностранного гражданина, регистрируемого в качестве индивидуального предпринимателя (в случае если физическое лицо, регистрируемое в качестве индивидуального предпринимателя, является иностранным гражданином).
Копия документа, предусмотренного федеральным законом или признаваемого в соответствии с международным договором Российской Федерации в качестве документа, удостоверяющего личность лица без гражданства, регистрируемого в качестве индивидуального предпринимателя (в случае если физическое лицо, регистрируемое в качестве индивидуального предпринимателя, является лицом без гражданства).
Копия свидетельства о рождении физического лица, регистрируемого в качестве индивидуального предпринимателя, или копия иного документа, подтверждающего дату и место рождения указанного лица в соответствии с законодательством Российской Федерации или международным договором Российской Федерации (в случае если представленная копия документа, удостоверяющего личность физического лица, регистрируемого в качестве индивидуального предпринимателя, не содержит сведений о дате и месте рождения указанного лица).
Копия документа, подтверждающего право физического лица, регистрируемого в качестве индивидуального предпринимателя, временно или постоянно проживать в Российской Федерации (в случае если физическое лицо, регистрируемое в качестве индивидуального предпринимателя, является иностранным гражданином или лицом без гражданства).
Подлинник или копия документа, подтверждающего в установленном законодательством Российской Федерации порядке адрес места жительства физического лица, регистрируемого в качестве индивидуального предпринимателя, в Российской Федерации (в случае если представленная копия документа, удостоверяющего личность физического лица, регистрируемого в качестве индивидуального предпринимателя, или документа, подтверждающего право физического лица, регистрируемого в качестве индивидуального предпринимателя, временно или постоянно проживать в Российской Федерации, не содержит сведений о таком адресе).
Нотариально удостоверенное согласие родителей, усыновителей или попечителя на осуществление предпринимательской деятельности физическим лицом, регистрируемым в качестве индивидуального предпринимателя, либо копия свидетельства о заключении брака физическим лицом, регистрируемым в качестве индивидуального предпринимателя, либо копия решения органа опеки и попечительства или копия решения суда об объявлении физического лица, регистрируемого в качестве индивидуального предпринимателя, полностью дееспособным (в случае если физическое лицо, регистрируемое в качестве индивидуального предпринимателя, является несовершеннолетним).
Решение комиссии по делам несовершеннолетних и защите их прав, созданной высшим исполнительным органом государственной власти субъекта Российской Федерации, о допуске к предпринимательской деятельности в сфере образования, воспитания, развития несовершеннолетних, организации их отдыха и оздоровления, медицинского обеспечения, социальной защиты и социального обслуживания, в сфере детско-юношеского спорта, культуры и искусства с участием несовершеннолетних (в случае если в отношении данного физического лица принято такое решение в соответствии с абзацем третьим пункта 4 статьи 22.1 Федерального закона от 08.08.2001 №129-ФЗ).
Уведомление о переходе на упрощенную систему налогообложения (предоставляется по желанию заявителя).

Заявитель вправе по собственной инициативе представить:

Справка о наличии (отсутствии) судимости и (или) факта уголовного преследования либо о прекращении уголовного преследования по реабилитирующим основаниям, выданная физическому лицу, регистрируемому в качестве индивидуального предпринимателя, в порядке и по форме, которые устанавливаются федеральным органом исполнительной власти, осуществляющим функции по выработке и реализации государственной политики и нормативно‑правовому регулированию в сфере внутренних дел (в случае если данное физическое лицо намерено осуществлять определенные виды предпринимательской деятельности, указанные в подпункте «к» пункта 1 статьи 22. 1 Федерального закона от 08.08.2001 №129‑ФЗ).

Уведомление о переходе на упрощенную систему налогообложения (предоставляется по желанию заявителя).

XV. В случае предоставления государственной услуги по внесению изменений в сведения об индивидуальном предпринимателе, содержащиеся в ЕГРИП, заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о внесении в ЕГРИП изменений по форме №Р24001.
Копия документа, подтверждающего изменение ранее внесенных в ЕГРИП сведений о фамилии, имени, отчестве, документе, удостоверяющем личность, месте жительства индивидуального предпринимателя — иностранного гражданина или лица без гражданства.
Решение комиссии по делам несовершеннолетних и защите их прав, созданной высшим исполнительным органом государственной власти субъекта Российской Федерации, о допуске к предпринимательской деятельности в сфере образования, воспитания, развития несовершеннолетних, организации их отдыха и оздоровления, медицинского обеспечения, социальной защиты и социального обслуживания, в сфере детско‑юношеского спорта, культуры и искусства с участием несовершеннолетних (в случае если в отношении данного физического лица принято такое решение).
Документ, удостоверяющий личность.
Документ, подтверждающий адрес места жительства (пребывания) индивидуального предпринимателя на территории Санкт-Петербурга.

XVI. В случае предоставления государственной услуги при прекращения физическим лицом деятельности в качестве индивидуального предпринимателя в связи с принятием им решения о прекращении данной деятельности заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о государственной регистрации по форме №Р26001.
Документ, удостоверяющий личность.
Документ, подтверждающий адрес места жительства (пребывания) индивидуального предпринимателя на территории Санкт-Петербурга.

Заявитель вправе по собственной инициативе представить:

XVII. В случае предоставления государственной услуги по государственной регистрации крестьянского (фермерского) хозяйства заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о государственной регистрации по форме №Р21002.
Копия основного документа физического лица, удостоверяющего личность гражданина Российской Федерации на территории Российской Федерации (в случае если глава крестьянского (фермерского) хозяйства, является гражданином Российской Федерации).
Копия документа, установленного федеральным законом или признаваемого в соответствии с международным договором Российской Федерации в качестве документа, удостоверяющего личность иностранного гражданина, являющегося главой крестьянского (фермерского) хозяйства (в случае если глава крестьянского (фермерского) хозяйства является иностранным гражданином).
Копия документа, предусмотренного федеральным законом или признаваемого в соответствии с международным договором Российской Федерации в качестве документа, удостоверяющего личность лица без гражданства, являющегося главой крестьянского (фермерского) хозяйства (в случае если глава крестьянского (фермерского) хозяйства является лицом без гражданства).
Копия свидетельства о рождении главы крестьянского (фермерского) хозяйства, или копия иного документа, подтверждающего дату и место рождения указанного лица в соответствии с законодательством Российской Федерации или международным договором Российской Федерации (в случае если представленная копия документа, удостоверяющего личность главы крестьянского (фермерского) хозяйства, не содержит сведений о дате и месте рождения указанного лица).
Копия документа, подтверждающего право главы крестьянского (фермерского) хозяйства временно или постоянно проживать в Российской Федерации (в случае если глава крестьянского (фермерского) хозяйства является иностранным гражданином или лицом без гражданства).
Подлинник или копия документа, подтверждающего в установленном законодательством Российской Федерации порядке адрес места жительства главы крестьянского (фермерского) хозяйства в Российской Федерации (в случае если представленная копия документа, удостоверяющего личность главы крестьянского (фермерского) хозяйства, или документа, подтверждающего право главы крестьянского (фермерского) хозяйства временно или постоянно проживать в Российской Федерации, не содержит сведений о таком адресе).
Нотариально удостоверенное согласие родителей, усыновителей или попечителя на осуществление главой крестьянского (фермерского) хозяйства предпринимательской деятельности, либо копия свидетельства о заключении брака главой крестьянского (фермерского) хозяйства, либо копия решения органа опеки и попечительства или копия решения суда об объявлении главы крестьянского (фермерского) хозяйства, полностью дееспособным (в случае если глава крестьянского (фермерского) хозяйства, является несовершеннолетним).
Уведомление о переходе на упрощенную систему налогообложения (предоставляется по желанию заявителя).

XVIII. В случае предоставления государственной услуги по внесению изменений в сведения о крестьянском (фермерском) хозяйстве, содержащиеся в ЕГРИП, заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о внесении изменений с сведения, содержащиеся в ЕГРИП, по форме №Р24002.
Копия документа, подтверждающего изменение ранее внесенных в ЕГРИП сведений о фамилии, имени, отчестве, документе, удостоверяющем личность, месте жительства главы крестьянского (фермерского) хозяйства — иностранного гражданина или лица без гражданства.
Документ, подтверждающий адрес места жительства (пребывания) физического лица на территории Санкт-Петербурга.

XIX. В случае предоставления государственной услуги при прекращении крестьянского (фермерского) хозяйства по решению его членов заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о государственной регистрации по форме №Р26002.
Документ, подтверждающий адрес места жительства (пребывания) физического лица на территории Санкт-Петербурга.

Заявитель вправе по собственной инициативе представить:

Документ, подтверждающий представление в территориальный орган Пенсионного фонда Российской Федерации сведений в соответствии с подпунктами 1 — 8 пункта 2 статьи 6 и пунктом 2 статьи 11 Федерального закона от 01.04.1996 №27‑ФЗ и в соответствии с частью 4 статьи 9 Федерального закона от 30.04.2008 №56‑ФЗ.

XX. В случае предоставления государственной услуги по внесению в ЕГРИП записи о крестьянском (фермерском) хозяйстве, зарегистрированном до вступления в силу части первой Гражданского кодекса Российской Федерации, заявитель в обязательном порядке представляет:

Подписанное заявителем заявление о государственной регистрации по форме №Р27002.
Копия основного документа физического лица, удостоверяющего личность гражданина Российской Федерации на территории Российской Федерации (в случае если глава крестьянского (фермерского) хозяйства, является гражданином Российской Федерации).
Копия документа, установленного федеральным законом или признаваемого в соответствии с международным договором Российской Федерации в качестве документа, удостоверяющего личность иностранного гражданина, являющегося главой крестьянского (фермерского) хозяйства (в случае если глава крестьянского (фермерского) хозяйства является иностранным гражданином).
Копия документа, предусмотренного федеральным законом или признаваемого в соответствии с международным договором Российской Федерации в качестве документа, удостоверяющего личность лица без гражданства, являющегося главой крестьянского (фермерского) хозяйства (в случае если глава крестьянского (фермерского) хозяйства является лицом без гражданства).
Копия свидетельства о рождении главы крестьянского (фермерского) хозяйства, или копия иного документа, подтверждающего дату и место рождения указанного лица в соответствии с законодательством Российской Федерации или международным договором Российской Федерации (в случае если представленная копия документа, удостоверяющего личность главы крестьянского (фермерского) хозяйства, не содержит сведений о дате и месте рождения указанного лица).
Копия документа, подтверждающего право главы крестьянского (фермерского) хозяйства временно или постоянно проживать в Российской Федерации (в случае если глава крестьянского (фермерского) хозяйства является иностранным гражданином или лицом без гражданства).
Подлинник или копия документа, подтверждающего в установленном законодательством Российской Федерации порядке адрес места жительства главы крестьянского (фермерского) хозяйства в Российской Федерации (в случае если представленная копия документа, удостоверяющего личность главы крестьянского (фермерского) хозяйства, или документа, подтверждающего право главы крестьянского (фермерского) хозяйства временно или постоянно проживать в Российской Федерации, не содержит сведений о таком адресе).
Нотариально удостоверенное согласие родителей, усыновителей или попечителя на осуществление главой крестьянского (фермерского) хозяйства предпринимательской деятельности, либо копия свидетельства о заключении брака главой крестьянского (фермерского) хозяйства, либо копия решения органа опеки и попечительства или копия решения суда об объявлении главы крестьянского (фермерского) хозяйства полностью дееспособным (в случае если глава крестьянского (фермерского) хозяйства является несовершеннолетним).
Документ, подтверждающий адрес места жительства (пребывания) физического лица на территории Санкт-Петербурга.

Комментарий:

В случае ликвидации юридического лица через процедуру банкротства государственная регистрация осуществляется без участия заявителя на основании определения арбитражного суда о завершении конкурсного производства, поступившего в регистрирующий орган из арбитражного суда путем направления указанного определения заказным письмом с уведомлением о вручении либо в электронной форме с использованием информационно‑телекоммуникационных сетей общего пользования, в том числе сети Интернет.
Необходимые для государственной регистрации заявление, уведомление или сообщение удостоверяются подписью заявителя, подлинность которой должна быть засвидетельствована в нотариальном порядке. Свидетельствование в нотариальном порядке подписи заявителя не требуется в случае:

представления документов, указанных в п.I, непосредственно в регистрирующий орган лично заявителем с представлением одновременно документа, удостоверяющего его личность;
представления документов, указанных в п.XIV, XV и XVI, в регистрирующий орган непосредственно лично заявителем с представлением одновременно документа, удостоверяющего его личность;
направления документов в регистрирующий орган в установленном порядке в форме электронных документов, подписанных усиленной квалифицированной электронной подписью заявителя.

Необходимо обязательно предоставить адрес электронной почты.

границ | Интерферон I типа регулирует выживаемость и функциональность В-клеток радужной форели

Введение

Интерфероны (IFN) представляют собой мощные противовирусные цитокины, индуцируемые в ходе вирусных инфекций, которые подразделяются на три класса (типы I, II и III) на основе используемых рецепторов, их геномной организации, последовательности или структурной гомологии (1). Хотя IFN типа I и типа II первоначально были разделены на основе клеток, ответственных за их продукцию, теперь очевидно, что они различаются на многих уровнях.Оба типа цитокинов участвуют в ответе на вирусную инфекцию, но, хотя IFN типа I хорошо известны своим противовирусным действием, IFN типа II играют иммунорегуляторные функции во время инфекции (2, 3). Таким образом, IFN типа I составляют большое семейство близкородственных цитокинов, классифицируемых у млекопитающих как IFNα, IFNβ, IFNε, IFNκ, IFNω, IFNδ, IFNζ и IFNτ (3, 4). Эти цитокины продуцируются почти каждым типом клеток при распознавании вируса или вирусоподобного стимула. После секреции эти IFN связываются со своим рецептором на поверхности клетки и инициируют сигнальный каскад, который в конечном итоге приводит к регуляции транскрипции сотен стимулированных IFN генов (ISG) [обзор в (5)].Среди этих IFN-индуцированных белков типа I многие из них, такие как белки устойчивости к миксовирусу (Mx), напрямую препятствуют репликации вируса (6). С другой стороны, IFNγ, единственный IFN типа II, обнаруженный у млекопитающих, секретируется почти исключительно NK- и T-лимфоцитами в ответ на определенные цитокины (7). Было показано, что IFNγ индуцирует продукцию оксида азота (NO), фагоцитоз и секрецию провоспалительных цитокинов макрофагов, способствуя их поляризации до фенотипа M1 (8). IFNγ также играет важную роль в презентации антигена, поскольку он увеличивает экспрессию MHC II и созревание макрофагов и дендритных клеток (ДК) (8, 9).Интересно, что хотя только ограниченная часть клеток экспрессирует IFNγ, его рецептор экспрессируется повсеместно, и благодаря этому взаимодействию IFNγ также способен вызывать противовирусные эффекты, аналогичные тем, которые вызываются IFN типа I (10). С другой стороны, IFN млекопитающих типа III представляют собой группу из четырех цитокинов, которые активируют сигнальный путь, аналогичный таковому для IFN типа I, через специфический рецептор (11, 12).

В дополнение к их прямому противовирусному действию на млекопитающих стало очевидным, что IFN типа I также играют плейотропные эффекты во время развития и дифференцировки B-клеток (13).У мышей, например, было показано, что IFNα / β увеличивает выживаемость B-клеток за счет уменьшения Fas-опосредованного апоптоза (14, 15) и усиливает ответы на лигирование рецепторов B-клеток (BCR), такие как мобилизация кальция, Интернализация IgM, индукция маркеров активации или пролиферация (14). Кроме того, IFN типа I значительно усиливают ответ B-клеток на лиганды Toll-подобного рецептора 7 (TLR7) (16) и действуют синергично с интерлейкином 6 (IL6), способствуя дифференцировке B-клеток в плазматические клетки, секретирующие антитела (17). .Таким образом, IFN млекопитающих типа I влияют на функции B-клеток посредством широкого спектра прямых эффектов или косвенно, регулируя DC или макрофаги, которые, в свою очередь, влияют на функциональность B-клеток (13, 18, 19). В этом контексте неудивительно, что прогрессирование системных аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка (СКВ), часто связано с повышенной выработкой интерферона I типа (13), поскольку уровни интерферона у пациентов с СКВ коррелируют с производством аутоантител (20).

Костистые рыбы также обладают множеством IFN типа I, количество которых варьируется в зависимости от вида рыб [обзор в (21)].Число генов IFN типа I особенно велико в определенных линиях костистых, таких как лососевые, возможно, как следствие дополнительной дупликации всего генома (WGD), которая имела место на протяжении всей эволюции в этой линии. IFN рыб типа I можно филогенетически разделить на три основные группы (22), разделенные на 6 подгрупп (a, b, c, d, e и f) у лососевых. IFNa, IFNd и IFNe относятся к группе I, IFNb и IFNc — к группе II, а IFNf — к группе III, с множественными генами, присутствующими в большинстве подгрупп (23).Важно уточнить, что IFNa и IFNb не являются ортологами IFNα и IFNβ млекопитающих. К настоящему времени подтверждена противовирусная активность нескольких IFN костистого типа I, включая IFNa, IFNb и IFNc (24–26). Напротив, IFNd проявлял небольшую противовирусную активность или не проявлял ее вовсе у лосося (или рыбок данио) (25, 26). Хотя существует единственный ген для IFNγ в большинстве групп позвоночных, опять же как следствие WGD, два гена обнаружены у лососевых и карповых (27, 28). Хотя на этих видах было проведено мало функциональных исследований относительно того, существуют ли различия между двумя паралогами IFNγ, несколько независимых исследований транскрипции не выявили серьезных различий в отношении их регуляторных механизмов (27, 29-31).Интересно, что некоторые виды костистых тел [обзор в (32)] имеют дополнительный IFNγ-подобный ген, обозначенный как IFNγ-rel, который предположительно произошел в результате тандемной дупликации костистых костей. Что касается биоактивности IFNγ и IFNγ-rel, большинство анализов, проведенных до сих пор на костистых костях, были в основном сосредоточены на анализе его эффектов на макрофаги [см. Обзор (32)].

У костистых рыб к настоящему времени описаны три класса Ig: IgM, IgD и IgT (специфический для костистых рыб Ig), которые определяют различные подмножества B-клеток.IgM ⁺ IgD ⁺ составляют основной тип В-клеток в центральных иммунных тканях, таких как периферическая кровь, селезенка и головная почка (главный орган кроветворения). Как описано у млекопитающих, после активации эти наивные клетки теряют экспрессию поверхностного IgD, превращаясь в клетки IgM ⁺ IgD ^— (33). Кроме того, как также сообщалось в конкретных компартментах слизистой оболочки человека и мышей (34–36), В-клетки, экспрессирующие исключительно IgD на клеточной поверхности, были идентифицированы в крови сома ( Ictalurus punctatus ) (37) и радужной форели ( Oncorhynchus mykiss ). ) жабры (38) и кишечник (39).Функция этих клеток до сих пор неизвестна. Клетки IgT ⁺, с другой стороны, составляют отдельный клон B-клеток, который, по-видимому, специализируется на ответах слизистой оболочки, поскольку соотношение B-клеток IgT ⁺ к IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток выше в поверхности слизистой оболочки, и было показано, что ответы IgT ограничиваются компартментами слизистой оболочки в ответ на некоторые инфекции (40, 41). Интересно, что В-клетки IgM ⁺ IgD ⁺ рыб обладают многими фенотипическими и функциональными характеристиками, присущими В1-клеткам млекопитающих (42, 43), врожденным В-клеткам, которые немедленно реагируют на антигены с образованием естественных антител, которые препятствуют репликации патогенов. пока не установится специфический иммунный ответ (44).В этом контексте представлялось весьма актуальным установить, как наивные рыбьи IgM ⁺ IgD ⁺ B-клетки реагируют на врожденные сигналы, производимые на ранних стадиях патогенного воздействия, такие как IFN.

На сегодняшний день вопрос о том, влияют ли IFN типа I или II на функциональность B-клеток, был рассмотрен только у рыб в одном исследовании, в котором было показано, что IFN типа I камбалы ( Paralichthys olivaceus ) усиливает фагоцитарную способность B-клеток IgM ⁺. а также производство ими активных форм кислорода (АФК) (45).В текущем исследовании мы изучили влияние IFN типа I и типа II на B-клетки IgM ⁺, используя радужную форель ( Oncorhynchus mykiss ) в качестве модельного вида. Для этого мы стимулировали лейкоциты периферической крови радужной форели (PBL) рекомбинантными IFNa и IFNγ форели (rIFNa и rIFNγ), а затем изучили различные функции наивных B-клеток. Мы решили провести эти исследования с PBL, так как у радужной форели в крови обнаруживается более высокий процент В-клеток IgM ⁺, IgD ⁺, ~ 44% (46).Наши результаты демонстрируют, что, хотя IFNa регулирует многие аспекты функциональности B-клеток, IFN типа II оказывает лишь незначительное влияние на секрецию IgM. Воздействие IFNa форели на наивные В-клетки включает увеличение выживаемости за счет снижения апоптоза, усиление фагоцитарной способности и усиление секреции IgM и транскрипции Mx. Однако, в отличие от IFN типа I млекопитающих, IFNa форели не способен синергизировать с передачей сигналов BCR. Таким образом, это исследование демонстрирует, что, помимо прямого противовирусного воздействия, IFN костистого типа I играют важную роль в регуляции В-клеточных ответов, как у млекопитающих.Различия между эффектами, оказываемыми на млекопитающих и рыб, скорее всего, будут следствием значительных различий, существующих между обычными В-клетками млекопитающих и В-клетками рыб.

Материалы и методы

Экспериментальная рыба

Здоровая радужная форель ( Oncorhynchus mykiss ) весом ~ 50–70 г была получена из Piscifactoria Cifuentes (Сифуэнтес, Гвадалахара, Испания) и содержалась в помещениях для животных Центра исследований здоровья животных (CISA-INIA, Испания) в вентилируемом помещении. система рециркуляции воды при 15 ° C, фотопериод свет: темнота 12:12 ч.Рыбу кормили дважды в день коммерческой диетой (Skretting, Испания). Перед любой экспериментальной процедурой рыб акклиматизировали в лабораторных условиях в течение не менее 2 недель. В этот период клинических признаков заболевания не наблюдалось.

Выделение лейкоцитов

Радужную форель убивали бензокаином (Sigma-Aldrich), а кровь извлекали гепаринизированной иглой из хвостовой вены. Кровь разбавляли в 10 раз средой Лейбовица (L-15, Gibco), содержащей 100 I.Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (P / S, Life Technologies), 10 МЕ / мл гепарина и 5% фетальной телячьей сыворотки (FCS, Thermo Fisher Scientific), а затем помещали на плотность 51% перколла (GE Healthcare). градиенты. Суспензии клеток центрифугировали при 400 × g в течение 30 мин при 4 ° C, интерфейсные клетки собирали и промывали L-15 с добавлением антибиотиков и 5% FCS. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли путем исключения трипанового синего (Sigma-Aldrich), и клетки ресуспендировали в L-15 с 5% FCS в концентрации 2 × 10 ⁶ клеток / мл.

Производство рекомбинантных интерферонов

rIFNa и rIFNγ получали, как описано ранее (47, 48). Оба рекомбинантных белка были экспрессированы в Escherichia coli BL21 Star (DE3) с помощью индукции изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) и очищены в денатурирующих условиях с обширной промывкой буфером, содержащим Тритон X-100, для удаления липополисахарида (LPS) как описано ранее. Очищенные белки повторно упаковывали в буфере, содержащем 0,5 М аргинин, и повторно очищали в нативных условиях (47–49).Биоактивность была установлена путем тестирования их способности индуцировать экспрессию специфических генов-мишеней, таких как Mx и CXCL11_L1 in vitro , в клеточных линиях радужной форели, таких как клеточная линия моноцитов / макрофагов радужной форели RTS11 (47, 48). Оба белка не влияли на экспрессию известных LPS-чувствительных генов, таких как IL1β и кателицидин-1 в клетках RTS11 (50), что подтверждает отсутствие контаминации LPS.

Стимуляция клеток

Лейкоциты периферической крови (PBL), суспендированные в среде L-15 с добавлением антибиотиков и 5% FCS, разливали в 24 (2 × 10 ⁶ клеток / лунку) или 96-луночные планшеты (4 × 10 ⁵ клеток. / well) (Nunc), в зависимости от эксперимента.RIFNa и rIFNγ использовали в конечных концентрациях 50 и 20 нг / мл, соответственно, после установления того, что это были концентрации, которые оказывали максимальные эффекты с точки зрения выживаемости В-клеток и экспрессии гена mx (данные не показаны). Эти концентрации соответствуют предыдущим результатам (47, 48, 51). Во все эксперименты были включены контроли, инкубированные только со средой. Лейкоциты культивировали при 20 ° C в течение разного времени в зависимости от эксперимента.

Проточная цитометрия

Клетки окрашивали IgM против форели [1.14 mAb мышиный IgG1, связанный с R-фикоэритрином (R-PE), 0,25 мкг / мл], IgD против форели [mAb мышиный IgG1, связанный с аллофикоцианином (APC), 4 мкг / мл] и β-цепь MHC II против форели [mAb мышиный IgG1, связанный с изотиоцианатом флуоресцеина (FITC), 4 мкг / мл] в течение 1 ч при 4 ° C, как описано ранее (52–54). Антитела флуоресцентно метили с использованием наборов для маркировки R-PE, APC или FITC Lightning-Link (Innova Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. После окрашивания клетки дважды промывали буфером для окрашивания (среда L-15 без фенолового красного с добавлением 2% FCS).Жизнеспособность клеток проверяли добавлением 4 ‘, 6-диамин-2’-фенилиндол дигидрохлорида (DAPI, 0,2 мкг / мл). Клетки анализировали на проточном цитометре FACS Celesta (BD Biosciences), оборудованном программным обеспечением BD FACSDiva ™. Анализ проточной цитометрии выполняли с помощью FlowJo V10 (TreeStar).

Пролиферация лейкоцитов

Набор для проточной цитометрии Click-iT ™ Plus EdU Alexa Fluor ™ 488 (Invitrogen ™) использовался для измерения пролиферации B-клеток IgM ⁺ IgD ⁺ в соответствии с инструкциями производителя.PBL инкубировали в течение 3 дней при 20 ° C в 96-луночных планшетах только с rIFN или средой. В некоторых экспериментах PBL также стимулировали немеченым моноклональным антителом (mAb) против IgM форели (клон 1.14, мышиный IgG1) в конечной концентрации 10 мкг / мл, чтобы вызвать перекрестное связывание BCR, как описано ранее (43). Через 3 дня к культурам добавляли 0,1 мкМ 5-этинил-2′-дезоксиуридина (EdU), которые затем инкубировали в течение 24 часов. После этого клетки собирали и окрашивали с помощью набора LIVE / DEAD ^® Fixable Dead Cell Stain Kit (Invitrogen ™) в течение 30 минут при 4 ° C (в защищенном от света) для проверки жизнеспособности клеток в соответствии с инструкциями производителя.Впоследствии клетки окрашивали IgM против форели (1,14 mAb мышиный IgG1, связанный с R-PE, 0,25 мкг / мл) и IgD против форели (mAb мышиный IgG1, связанный с APC, 4 мкг / мл) в течение 1 ч при 4 ° С. C, как описано выше, и анализировали на проточном цитометре FACS Celesta.

Апоптоз

Анализ апоптоза выполняли с использованием набора для обнаружения апоптоза PE Annexin V (BD Pharmingen ™) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, PBL инкубировали в течение 48 или 72 часов при 20 ° C в 96-луночных планшетах с rIFN или только со средой.После этого клетки окрашивали IgM против форели [1,14 mAb мышиного IgG1, связанного с FITC, 0,425 мкг / мл] в течение 20 мин при 4 ° C. После промывки окрашивающим буфером клетки центрифугировали при 400 × g в течение 5 минут при 4 ° C и 1,5 мкл PE Аннексина V и 4 мкл 7-аминоактиномицина D (7-AAD) на 200 мкл 1X Annex. V Binding Buffer добавлен к клеткам. Затем клетки инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) в темноте перед переносом в пробирки для проточной цитометрии (Falcon ^®, 5 мл пробирка из полистирола с круглым дном, Corning), содержащие 400 мкл 1X буфера для связывания с приложением V, и анализировали в течение 1 ч на проточном цитометре FACS Celesta.

Фагоцитарная активность

PBL высевали в 24-луночные планшеты и инкубировали в течение 72 часов при 20 ° C с rIFN или только средой. Затем клетки собирали и ресуспендировали в среде L-15, дополненной антибиотиками без сыворотки, и инкубировали в течение 3 часов при 20 ° C с флуоресцентными шариками (микросферы, модифицированные карбоксилатом FluoSpheres ™, 1,0 мкм, малиновые флуоресцентные (625/645), 2% solids, Invitrogen ™) при соотношении ячейки: гранулы 1:10, как описано ранее (55). После периода инкубации клетки собирали осторожным пипетированием, и непроглоченные шарики удаляли центрифугированием (100 × г в течение 10 мин при 4 ° C) над подушкой из 3% (вес / объем) бычьего сывороточного альбумина ( BSA) лиофилизированный порошок ≥96% (Sigma-Aldrich) в PBS с добавлением 4.5% (вес / объем) D (+) — моногидрат глюкозы (Merck). Затем клетки ресуспендировали в буфере для окрашивания, метили анти-IgM-FITC (1,14) (0,425 мкг / мл) и анти-IgD-PE (40 мкг / мл) и анализировали на проточном цитометре FACS Celesta. Жизнеспособность клеток проверяли окрашиванием клеток DAPI (0,2 мкг / мл). В некоторых экспериментах цитохалазин B (0,05 мкг / мл) добавляли к клеткам непосредственно перед добавлением шариков для проверки активного фагоцитоза, как описано ранее (55). Анализ проточной цитометрии выполняли с помощью FlowJo V10, чтобы рассчитать соотношение между процентным содержанием фагоцитарных B-клеток IgM ⁺ в общей популяции B-клеток IgM ⁺, соотношение между процентным содержанием высокофагоцитарных B-клеток IgM ⁺ среди общая популяция фагоцитарных В-клеток IgM ⁺ и средняя интенсивность флуоресценции (MFI) интернализованных гранул во всех фагоцитарных клетках IgM ⁺.

Анализ ELISPOT

PBL от отдельных рыб стимулировали rIFN в течение 72 часов при 20 ° C или оставляли нестимулированными в тех же условиях в 96-луночных планшетах. Планшеты ELISPOT, содержащие мембраны Inmobilon-P (Millipore), активировали 70% этанолом в течение 30 с, покрывали mAb против IgM (клон 4C10) в концентрации 2 мкг / мл в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) и инкубировали в течение ночи при 4 ^? C. Для блокирования неспецифического связывания с мембраной планшеты инкубировали с 2% BSA в PBS в течение 2 часов при комнатной температуре.На этом этапе клетки, которые стимулировали rIFN в течение 72 часов, или нестимулированные клетки переносили в планшеты для ELISPOT (5 × 10 ⁴ клеток / лунку) и оставляли на ночь при 20 ° C. На следующий день клетки смывали пять раз PBS и планшеты снова блокировали 2% BSA в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. После блокирования в планшеты добавляли биотинилированное mAb против IgM (клон 4C10) и инкубировали при 1 мкг / мл в течение 1 ч при комнатной температуре. После пяти стадий промывки (в PBS) планшеты проявляли с использованием стрептавидин-HRP (Thermo Scientific) в течение 1 часа при комнатной температуре, снова промывали PBS и инкубировали с 3-амино-9-этилкарбазолом (Sigma-Aldrich) в течение 30 минут при комнатной температуре. RT в темноте.Реакцию субстрата останавливали промыванием планшетов водопроводной водой. После высыхания мембран их сканировали цифровым способом и определяли количество пятен в каждой лунке с помощью системы чтения AID iSpot (Autoimmun Diagnostika GMBH).

Сортировка ячеек

PBL высевали в 24-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 ч с rIFN или только со средой при 20 ° C. На этом этапе клетки собирали и инкубировали в течение 1 ч при 4 ° C с анти-IgM-FITC и анти-форелевым IgD-APC, как описано выше.После нескольких этапов промывки клетки ресуспендировали в окрашивающем буфере и выделяли B-клетки IgM ⁺ IgD ⁺ с помощью проточной цитометрии с использованием сортировщика клеток BD FACSAria III (BD Biosciences) на основе их профиля FSC / SSC, а затем на основе флуоресценция, испускаемая антителами против IgM и IgD. Приблизительно 70000 В-клеток IgM ⁺ IgD ⁺ собирали в PBS для последующего выделения РНК.

Чтобы подтвердить прямое влияние rIFN на выживаемость B-клеток IgM ⁺ IgD ⁺, PBL инкубировали в течение 1 ч при 4 ° C с биотинилированным Fab-фрагментом анти-IgM 1.14 (чтобы избежать активации клеток) в буфере для окрашивания. После двух стадий промывки добавляли стрептавидин-фикоэритрин (РЕ) (BD Pharmingen). Через 20 мин при 4 ° C клетки ресуспендировали в буфере для окрашивания и выделяли B-клетки IgM ⁺, IgD ⁺, как описано выше. Отсортированные IgM ⁺ B-клетки IgD ⁺ затем инкубировали с rIFN или только средой в течение 3 дней при 20 ° C. По истечении этого времени клетки контрастировали с 0,2 мкг / мл DAPI и анализировали на проточном цитометре FACS Celesta.

Анализ ПЦР в реальном времени

Суммарную РНК

выделяли из отсортированных по FACS IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток с использованием набора Power SYBR Green Cells-to-Ct (Invitrogen), следуя инструкциям производителя. Вкратце, общая РНК обрабатывалась ДНКазой во время процесса для удаления геномной ДНК, которая могла бы мешать реакциям ПЦР, а затем обратно транскрибировалась в кДНК в соответствии с инструкциями производителя. Чтобы оценить уровни транскрипции различных генов, проводили ОТ-ПЦР в реальном времени с помощью прибора LightCycler ^® 96 System (Roche) с использованием ядерных реагентов SYBR Green PCR (Applied Biosystems) и специфических праймеров (Таблица S1).Образцы, полученные от отдельных рыб, анализировали дважды при следующих условиях: 1 мин при 95 ° C, затем 45 циклов амплификации (15 с при 95 ° C и 1 мин при 60 ° C). Кривую плавления для каждого набора праймеров получали путем считывания флуоресценции на каждом градусе между 60 и 95 ° C, чтобы гарантировать, что был амплифицирован только один продукт ПЦР. Экспрессия отдельных генов была нормализована к относительной экспрессии β-актина гена домашнего хозяйства, а уровни экспрессии были рассчитаны с использованием метода 2 ⁽ -ΔCt), где ΔCt определяется вычитанием значения β-актина из целевого значения. Ct (пороговое значение Ct установлено на 38).Этот ген домашнего хозяйства был выбран после проверки того, что не было обнаружено статистических различий между значениями Ct β-актина, полученными из разных образцов. Отрицательные контроли без матрицы и контроли обратной транскриптазы минус были включены во все анализы.

Статистический анализ

Обработка, анализ и графическое представление данных были выполнены с использованием GraphPad Prism версии 7.00 для Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA (www.graphpad.com).Статистический анализ проводился с использованием двустороннего критерия Стьюдента t- , и различия между средними значениями считались значимыми, когда P ≤ 0,05.

Результаты

IFNa типа I увеличивает выживаемость IgM

⁺ IgD ⁺ B-клеток за счет уменьшения их спонтанного апоптоза

Наши результаты показывают, что инкубация PBL радужной форели с rIFNa значительно увеличивала выживаемость IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток через 72 часа (рисунки 1A, B).В этом и всех других экспериментах проточной цитометрии, описанных в статье, за исключением анализов апоптоза, дублеты и мертвые клетки были исключены из анализа в соответствии со стратегией стробирования, описанной на рисунке S1. rIFNa значительно увеличивал как процентное содержание B-клеток IgM ⁺, так и абсолютное количество B-клеток IgM ⁺ в культурах (рисунки 1A, B), в то время как rIFNγ оказывал только значительное влияние, увеличивая абсолютное количество IgM ⁺. В-клетки в культурах, но не влияли на процентное содержание В-клеток IgM ⁺ (Фигуры 1A, B).rIFNγ не влиял на выживаемость популяции лейкоцитов IgM ^—, тогда как rIFNa вызывал небольшое, но значительное снижение процентного содержания и общего количества клеток IgM ^— в культурах (Фигуры 1A, C). В этих экспериментах rIFNa и rIFNγ использовались в их оптимальных концентрациях (50 нг / мл и 20 нг / мл соответственно), как было установлено ранее (47, 48, 51), и в предварительных экспериментах, где в случае rIFNγ более высокие концентрации концентрации (50 нг / мл) имели аналогичные или даже более низкие эффекты на В-клетки IgM ⁺, IgD ⁺ (фигура S2).Поскольку этот эффект rIFNa на В-клетки IgM ⁺, IgD ⁺ мог быть косвенным, мы повторили эксперименты таким образом, что сначала были отсортированы IgM ⁺ IgD ⁺ В-клетки с анти-IgM Fab и затем стимулировали rIFN. Чистоту отсортированной популяции В-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии (рисунок S3). В этом случае снова только rIFNa значительно увеличивал выживаемость B-клеток IgM ⁺, IgD ⁺, демонстрируя прямое влияние этого цитокина на выживаемость (фигура 1D).

Рисунок 1 . Выживаемость IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток крови в ответ на IFN типа I и типа II. PBL стимулировали 50 нг / мл rIFNa, 20 нг / мл rIFNγ или одной средой (контроль) и культивировали при 20 ° C в течение 72 часов. Затем лейкоциты метили специфическими моноклональными антителами против IgM и IgD форели и анализировали проточной цитометрией. Клетки были заблокированы на основе их FSC и SSC и процентного содержания клеток IgM ⁺, IgD ⁺, определенных на синглетных и живых (DAPI-отрицательных) клетках.Показаны репрезентативные точечные графики для одной отдельной рыбы (A) вместе со средним процентом и общим количеством клеток, обнаруженных для IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток (B) и IgM ^— IgD ^— клеток. (C) (среднее + SEM; n = 9). В независимом эксперименте В-клетки отделяли от лейкоцитов крови с использованием биотинилированного Fab-фрагмента анти-IgM 1.14, а затем инкубировали с rIFN, как описано выше. Через 72 часа процент живых IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток и общее количество живых IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток, определенный с помощью проточной цитометрии, как описано в разделе «Материалы и методы» (среднее + SEM ; n = 7) (D) .Звездочки обозначают значительные различия между образцами, обработанными rIFN, и контрольными образцами (* P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001).

Чтобы определить, является ли эта повышенная выживаемость В-клеток в присутствии rIFNa следствием лимфопролиферативных эффектов этого цитокина, мы проанализировали пролиферативный эффект rIFNa и rIFNγ по отдельности или в сочетании с перекрестным связыванием BCR (посредством инкубации с антибиотиками). -IgM). Наши результаты ясно показали, что ни один из rIFN не оказывал значительного пролиферативного действия на IgM ⁺ B-клетки крови радужной форели сами по себе (рис. 2).Синергетических эффектов между перекрестным связыванием BCR и стимуляцией rIFN не наблюдалось (рис. 2).

Рисунок 2 . Пролиферативные эффекты IFN I и II типа на IgM ⁺ IgD ⁺ B крови. Лимфопролиферативные эффекты rIFNa и rIFNγ определяли путем инкубации PBL при 20 ° C с 50 нг / мл rIFNa, 20 нг / мл rIFNγ или только средой. Для каждого условия также были включены лунки, содержащие 10 мкг / мл немеченого анти-IgM. Через 72 часа клетки метили EdU (1 мкМ) и инкубировали еще 24 часа.На этом этапе клетки метили mAb против IgM и против IgD и определяли процентное содержание B-клеток IgM ⁺ IgD ⁺ со встроенными EdU (пролиферирующие клетки), как описано в разделе «Материалы и методы». Представленные точечные графики представлены вместе с графиком, показывающим количественную оценку пролиферирующих IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток (среднее значение + SEM; n = 8).

Другой возможный механизм, посредством которого rIFNa может увеличивать выживаемость B-клеток IgM ⁺ IgD ⁺, может заключаться в модуляции спонтанного апоптоза этих клеток.Чтобы проверить это, мы изучили апоптоз B-клеток IgM ⁺, IgD ⁺ через 48 или 72 часа инкубации с различными rIFN. В этих экспериментах популяция лейкоцитов регистрировалась и дублеты исключались из анализа, как показано на фиг. S1, хотя в этом случае использовался маркер жизнеспособности 7-AAD. Как через 48, так и через 72 ч, значительное снижение процента раннего (Аннексин V ⁺/7-AAD ^—) и позднего (Аннексин V ⁺/7-AAD ⁺) апоптозного IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток наблюдали после стимуляции rIFNa (Фигуры 3A, B).Интересно, что процентное соотношение B-клеток с ранним и поздним апоптозом IgM ⁺ IgD ⁺ было довольно схожим через 48 и 72 часа, что позволяет предположить, что B-клетки в основном погибают в течение первых 48 часов культивирования, тогда как те, которые выживают через 48 часов, остаются. жизнеспособны в течение более длительного периода времени. Этот эффект не наблюдался в ответ на rIFNγ. В целом, наши результаты демонстрируют, что rIFNa увеличивает выживаемость наивных В-клеток крови, спасая их от спонтанного апоптоза.

Рисунок 3 .Влияние IFN типа I и типа II на спонтанный апоптоз крови IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток. PBL инкубировали в течение 48 часов (A) или 72 часов (B) при 20 ° C с 50 нг / мл rIFNa, 20 нг / мл rIFNγ или только средой (контроль). Затем клетки окрашивали IgM против форели в течение 20 мин при 4 ° C. После отмывки PE Аннексин V и 7-AAD использовали для окрашивания клеток и выявления раннего (Аннексин V ⁺/7-AAD ^—) и позднего (Аннексин V ⁺/7-AAD ⁺) апоптоза. .Данные были проанализированы в течение 1 часа, как описано в разделе «Материалы и методы». Представленные точечные графики представлены вместе с графиками, показывающими количественную оценку апоптотических В-клеток IgM ⁺ (среднее значение + SEM; n = 6–9). Звездочки обозначают значительные различия между образцами, обработанными rIFN, и контрольными образцами (* P ≤ 0,05).

IFNa типа I увеличивает фагоцитарную активность IgM

⁺ IgD ⁺ B-клеток

Поскольку было показано, что B-клетки костистых животных обладают сильной фагоцитарной активностью (42), мы также исследовали, влияют ли rIFNa и rIFNγ на способность B-клеток IgM ⁺ IgD ⁺ B фагоцитировать микрочастицы.Для этого PBL предварительно обрабатывали rIFN, и через 72 часа проводили анализ фагоцитоза. Наши результаты показывают, что предварительная стимуляция В-клеток IgM ⁺, IgD ⁺ rIFNa значительно увеличивала процент фагоцитарных В-клеток IgM ⁺ IgD ⁺ в культурах по сравнению либо с нестимулированными клетками, либо с клетками, обработанными rIFNγ (рисунок 4). Кроме того, MFI интернализованных гранул в крови IgM ⁺ B-клеток, IgD ⁺ было значительно выше в клетках, обработанных rIFNa, по сравнению с контролем (рис. 4), как и процентное содержание IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток с большое количество проглоченных шариков (высокофагоцитарные IgM ⁺ IgD ⁺ B-клетки) (рис. 4).Когда мы проанализировали влияние этих цитокинов на популяцию IgM ^— IgD ^—, мы обнаружили, что в этом случае IFNa оказывал положительное влияние на процент фагоцитарных клеток, тогда как оба цитокина увеличивали процент высокофагоцитарных клеток в культурах. по сравнению с нестимулированными клетками.

Рисунок 4 . Влияние IFN типа I и типа II на фагоцитарную способность крови IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток. PBL инкубировали в течение 72 ч при 20 ° C с 50 нг / мл rIFNa, 20 нг / мл rIFNγ или только средой (контроль).По истечении этого времени клетки инкубировали с темно-красными флуоресцентными шариками (диаметром 1 мкм) в соотношении 1:10 (клетки / шарики) в течение следующих 3 часов при 20 ° C и фагоцитарную способность В-клеток устанавливали, как описано в материалах. и методы. Показаны характерные точечные графики для каждого экспериментального условия. Прямоугольные области содержат субпопуляции высокофагоцитарных клеток (клетки, которые интернализовали большее количество гранул) среди субпопуляций клеток IgM ⁺ (верхний) или IgM ^— (нижний).Верхние графики показывают процент фагоцитарных В-клеток IgM ⁺ в общей популяции В-клеток IgM ⁺ (слева), процент фагоцитарных клеток с высоким уровнем IgM ⁺ в общей популяции фагоцитарных В-клеток IgM ⁺ (средний ) и средней интенсивности флуоресценции (MFI) интернализованных шариков внутри фагоцитарных В-клеток IgM ⁺ (справа). На нижних графиках представлена такая же информация для популяции IgM ^–. Данные — это средние значения + SEM; n = 10.Звездочки обозначают значительные различия между образцами, обработанными rIFN, и контрольными образцами (* P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001).

IFN типов I и II повышают секрецию IgM

Затем мы изучили с помощью ELISPOT, влияют ли rIFN на способность В-клеток крови радужной форели секретировать IgM, путем определения количества IgM-секретирующих клеток (плазмобластов или плазматических клеток) в этих культурах PBL. В этом случае и rIFNa, и rIFNγ значительно увеличивали количество IgM-секретирующих клеток в культурах через 3 дня по сравнению с количеством IgM-секретирующих клеток, обнаруженных в нестимулированных культурах (Рисунок 5), хотя ответ на rIFNa был значительно выше, чем у rIFNγ.

Рисунок 5 . Влияние IFN типа I и типа II на дифференцировку B-клеток IgM ⁺, IgD ⁺ к IgM-секретирующим клеткам. PBL обрабатывали 50 нг / мл rIFNa, 20 нг / мл rIFNγ или только средой (контроль) и инкубировали в течение 72 часов при 20 ° C. После этого клетки добавляли в планшеты для ELISPOT, предварительно покрытые анти-IgM mAb (2 мкг / мл), и инкубировали еще 24 часа. Затем определяли количество клеток, секретирующих IgM, как описано в разделе «Материалы и методы».Показаны репрезентативные лунки от одного человека вместе с количественной оценкой пятнообразующих клеток (среднее значение + SEM; n = 12). Звездочки обозначают значительные различия между образцами, обработанными rIFN, и контрольными образцами (* P ≤ 0,05, *** P ≤ 0,001).

rIFN не влияют на антиген-презентирующую способность крови IgM

⁺ IgD ⁺ B-клеток

У млекопитающих IFNγ является одним из основных цитокинов, участвующих в стимуляции экспрессии MHC класса II в антигенпрезентирующих клетках (56).Аналогичным образом, стимуляция макрофагов RTS11 радужной форели с помощью 10 нг / мл rIFNγ значительно увеличивала транскрипцию MHC класса II между 24 и 72 часами после стимуляции (51). В этом контексте мы исследовали, могут ли rIFNγ и rIFNa модулировать экспрессию MHC II в B-клетках IgM ⁺ IgD ⁺, поскольку они также являются антигенпрезентирующими клетками. Сначала мы оценили поверхностную экспрессию MHC-II с помощью проточной цитометрии с использованием специфического антитела против форели MHC-II. В клетках IgM ⁺, IgD ⁺ B не наблюдалось значительной модуляции поверхностной экспрессии MHC II (фиг. 6A) или транскрипции MHC II (фиг. 6C).Кроме того, мы оценили влияние rIFN на уровень транскрипции CD80 / 86 и CD83, костимулирующих молекул, участвующих в презентации антигена, и снова никакого эффекта не было обнаружено (фиг. 6C). Интересно, что и rIFNa, и rIFNγ значительно увеличивали уровни поверхностного MHC II в клетках IgM ^— в этих культурах (рис. 6B). Эти результаты предполагают, что rIFNa и rIFNγ не модулируют антигенпредставляющую способность В-клеток радужной форели, несмотря на то, что они оказывают влияние на другие антигенпрезентирующие клетки, возможно, на моноциты / макрофаги.

Рисунок 6 . Влияние IFN типа I и типа II на антигенпрезентирующую способность клеток крови. PBL инкубировали с 50 нг / мл rIFNa, 20 нг / мл rIFNγ или одной средой (контроль) в течение 72 часов при 20 ° C. Уровень поверхностной экспрессии MHC-II на В-клетках IgM ⁺, IgD ⁺ и IgM ^— IgD ^— клеток затем измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием специфических mAb против MHC-II форели. Типичная гистограмма показана вместе с графиком средних значений MFI MHC-II для IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток (A) или IgM ^— IgD ^— клеток (B) (среднее + SEM; n = 9).В другом эксперименте лейкоциты крови обрабатывали rIFN, как описано выше, и через 24 часа В-клетки IgM ⁺ IgD ⁺ сортировали с помощью проточной цитометрии. РНК экстрагировали для определения уровней транскрипции mhcII, cd83 и cd80 / 86 (C) с помощью ПЦР в реальном времени. Данные по экспрессии генов были нормализованы относительно эндогенного контроля b-actin и показаны как относительная экспрессия (среднее + SEM; n = 10). Звездочки обозначают значительные различия между образцами, обработанными rIFN, и контрольными образцами (* P ≤ 0.05 и ** P ≤ 0,01).

IFN типа I индуцируют транскрипцию нескольких белков Mx в крови IgM

⁺ IgD ⁺ B-клетки Белки

Mx представляют собой динаминоподобные GTPазы, которые играют важную роль в противовирусном иммунитете. (57) Экспрессия Mx у млекопитающих обычно индуцируется IFN типа I и типа III, но не IFN типа II (58), хотя есть некоторые исключения из этого общего правила. были недавно обнаружены у костистых рыб (59). Интересно, что недавно было показано, что семейство белков Mx расширилось у лососевых: 10 различных генов mx присутствуют у атлантического лосося и 9 — у радужной форели (48).Однако, насколько нам известно, экспрессия Mx в В-клетках рыб не изучена. Наши результаты демонстрируют, что rIFNa значительно индуцировал транскрипцию Mx1, Mx3 и Mx5 (фиг.7) в отсортированных B-клетках IgM ⁺ IgD ⁺ и значительно повышал уровни мРНК Mx2, конститутивно транскрибируемой этими клетками ( Рисунок 7). rIFNγ, с другой стороны, не оказывал значительного влияния на транскрипцию Mx (рис. 7).

Рисунок 7 . Индукция транскрипции mx в крови IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток в ответ на IFN типа I или типа II.Лейкоциты крови инкубировали с 50 нг / мл rIFNa, 20 нг / мл rIFNγ или только средой (контроль) при 20 ° C. Через 24 часа IgM ⁺ IgD ⁺ B-клетки были отсортированы с помощью проточной цитометрии и извлечена РНК для определения уровней транскрипции различных генов mx , присутствующих в радужной форели ( mx1 — mx9 ). Данные по экспрессии генов были нормализованы относительно эндогенного контроля b-actin и показаны как относительная экспрессия (среднее + SEM; n = 10).Звездочки обозначают значительные различия между образцами, обработанными rIFN, и контрольными образцами (* P ≤ 0,05 и ** P ≤ 0,01).

Обсуждение

В дополнение к хорошо известным прямым противовирусным эффектам IFN типа I и способности IFN типа II модулировать презентацию антигена, теперь стало очевидно, что IFN также участвуют в регуляции развития и дифференцировки лимфоцитов. Однако обычно считается, что В-клетки в основном модулируются IFN типа I, тогда как Т-клетки в основном реагируют на IFN типа II (60).Чтобы исследовать, реагируют ли В-клетки рыб также на IFN типа I, мы изучили влияние модельного белка IFN I типа (IFNa) на наивные В-клетки крови и сравнили эффекты с эффектами, вызванными IFN типа II, продуцируемыми в тех же условиях. условия. В этих анализах оптимальные концентрации для каждого rIFN были установлены ранее и были разными для каждого белка (50 нг / мл для IFNa и 20 нг / мл для IFNγ) в соответствии с предыдущими публикациями (47, 48, 51). При этом все анализы, описанные в текущем исследовании, первоначально были выполнены с IFNγ в концентрации 50 нг / мл, но не было обнаружено значительных различий с результатами, представленными здесь (рисунок S2).

Первый эффект, который был четко виден при инкубации PBL с IFNa, заключался в том, что процентное содержание B-клеток IgM ⁺ IgD ⁺ и абсолютное количество IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток значительно увеличивалось в культурах. в присутствии цитокина через 72 ч. Поскольку многие другие типы лейкоцитов также присутствовали в этих культурах, возможно, что это увеличение в B-клетках было следствием воздействия IFNa на другие типы клеток, которые впоследствии активировали B-клетки.Например, IFN типа I млекопитающих, продуцируемый во время вирусной инфекции, может активировать DC и макрофаги с образованием BAFF и APRIL, которые, в свою очередь, активируют B-клетки (19). Следовательно, чтобы исключить возможные косвенные эффекты в наших экспериментах, мы отсортировали В-клетки крови форели и затем стимулировали их с помощью rIFNa. В этом случае наблюдались аналогичные положительные эффекты на выживаемость В-клеток, что указывает на прямой эффект цитокина. Это увеличение количества В-клеток в культурах PBL не было следствием индуцированных IFNα лимфопролиферативных эффектов, как было установлено с помощью анализов in vitro на пролиферацию .У млекопитающих IFN типа I спасает В-клетки от индуцированного Fas спонтанного апоптоза посредством механизма, включающего фосфорилирование AKT и повышающую регуляцию молекул, способствующих выживанию (14, 15). Таким образом, мы исследовали, может ли это быть причиной повышенной выживаемости В-клеток в культурах лейкоцитов крови. Наши результаты продемонстрировали, что IFNa вызывает значительное подавление спонтанного апоптоза В-клеток, предполагая механизм, аналогичный тому, который описан у млекопитающих. rIFNγ, с другой стороны, лишь незначительно увеличивал абсолютное количество B-клеток IgM ⁺ IgD ⁺ в культурах, но не влиял на процентное содержание IgM ⁺ IgD ⁺ B-клеток.Точно так же не было эффекта rIFNγ, когда клетки были отсортированы и затем инкубированы с цитокином, ни на апоптоз B-клеток. Следовательно, rIFNγ может оказывать некоторые незначительные эффекты на жизнеспособность B-клеток посредством косвенных механизмов, но на уровнях намного ниже, чем те, которые описаны здесь для rIFNa. Напротив, rIFNγ оказывал значительное влияние на фагоцитарную способность и уровни поверхностной экспрессии MHC II лейкоцитов IgM ^—, IgD ^—, присутствующих в культурах.

У млекопитающих IFN типа I действует как усилитель передачи сигналов BCR во время вирусных инфекций, переводя В-клетки в состояние частичной активации, при котором клетки имеют более высокую чувствительность к дальнейшей стимуляции через BCR (14).Таким образом, IFN типа I значительно усиливает ответы на лигирование BCR, которые включают пролиферацию, приток кальция, интернализацию IgM и индукцию маркеров активации (14). Однако у радужной форели rIFNa не взаимодействует с передачей сигналов BCR для индукции пролиферации. Причина такого разного ответа В-клеток форели может быть связана с тем фактом, что В-клетки рыб не пролиферируют в ответ только на лигирование BCR, в отличие от обычных клеток В2 млекопитающих, но сходных с клетками В1 млекопитающих (43). Фактически, существует много других функциональных и фенотипических сходств между В-клетками рыб и врожденными В1-клетками млекопитающих, которые включают сильную фагоцитарную способность, более длительную выживаемость в культуре клеток, низкую поверхностную экспрессию IgD или экспрессию B1-специфических маркеров (43).Интересно, что было показано, что rIFNa форели активирует одну из этих врожденных особенностей В-клеток рыб, их фагоцитарную активность, значительно увеличивая количество фагоцитарных В-клеток в культурах и процент В-клеток с большим количеством фагоцитированных гранул. В этом контексте было бы интересно исследовать на млекопитающих эффекты IFN типа I в B1-клетках млекопитающих и определить, например, индуцирует ли IFN типа I также фагоцитарную способность этих клеток, как установлено для B-клеток рыб.

IFN млекопитающих типа I, как неоднократно сообщалось, усиливает антительный ответ in vivo (61, 62). В этих экспериментах повышенные титры антител зависели от способности B-клеток напрямую отвечать на IFNα / β (61, 62), демонстрируя прямое влияние IFN типа I на дифференцировку B-клеток. Чтобы исследовать, способны ли rIFN сами по себе индуцировать дифференцировку В-клеток, наивных рыб, мы определили количество IgM-секретирующих клеток в культурах лейкоцитов крови после 72 часов воздействия.В этом случае и rIFNa, и rIFNγ значительно увеличивали количество плазмобластов / плазматических клеток в культурах, хотя, как наблюдалось на протяжении всех экспериментов, эффекты IFN типа I были значительно выше, чем эффекты IFN типа II. Возможно, это увеличение количества клеток, секретирующих IgM, является следствием общей повышенной выживаемости В-клеток в культурах, однако, в соответствии с нашими результатами, было показано, что IFNa атлантического лосося является мощным молекулярным адъювантом. для ДНК-вакцины против вируса инфекционной анемии лосося (ISAV), значительно увеличивающей специфические титры IgM к вакцине (63).Кроме того, когда был проведен транскриптомный анализ местного ответа на эту плазмиду, кодирующую IFNa, у атлантического лосося, IgM, IgD и IgT были среди генов, которые были сильно активированы (64).

Mx-генов присутствуют почти у всех позвоночных, обычно в виде одной-трех копий. У млекопитающих эти множественные копии, как правило, тесно связаны и возникают в результате локальных дупликаций генов (65). Однако, возможно, как следствие третьей WGD, специфичной для костистых животных, и более поздней WGD, специфичной для лососевых, семейство генов Mx, как и многие другие семейства генов, претерпело обширную диверсификацию, при этом у лососевых идентифицировано 6-10 различных генов (48, 59).У радужной форели присутствующие 9 генов Mx конститутивно транскрибировались макрофагами RTS11, и среди них Mx1-7 сильно индуцировались IFNa, в то время как только Mx5 и Mx6 увеличивали свои уровни мРНК в ответ на IFNγ (48). Точно так же у атлантического лосося гены mx показали дифференциальную чувствительность к IFN типа I и II, при этом гены на Chr12 сильно индуцировались IFN типа I, а гены Chr25 сильнее индуцировались IFNγ, чем IFN типа I (48, 59). Однако, насколько нам известно, какие гены mx экспрессируются в В-клетках, никогда не рассматривались у костистых рыб.Наши результаты показывают, что Mx4, Mx7, Mx8 и Mx9 не продуцируются B-клетками крови, тогда как Mx1, Mx2, Mx3 и Mx5 сильно активируются в ответ на rIFNa (но не IFNγ). Ограничивает ли эта индукция экспрессии Mx в B-клетках способность вирусов реплицироваться в этих клетках — это вопрос, который следует исследовать дополнительно, учитывая, что прямая противовирусная активность Mx-белков форели еще не была продемонстрирована.

В заключение мы сообщаем о ранее не описанной роли IFN костистого типа I в регуляции В-клеточных ответов.Наши результаты демонстрируют, что, как и у млекопитающих, IFNa увеличивает выживаемость наивных В-клеток, спасая их от спонтанного апоптоза и повышенной секреции IgM. Однако, в отличие от клеток В2 млекопитающих, В-клетки рыб, обработанные IFN типа I, не обладали повышенной реактивностью на стимуляцию BCR. Возможное объяснение этой разной реакции может быть связано с тем фактом, что В-клетки рыб по-разному реагируют на стимуляцию BCR, чем обычные В-клетки млекопитающих. Кроме того, учитывая, что В-клетки рыб фактически сохраняют некоторые врожденные функции, такие как сильная фагоцитарная способность, мы также установили, что ИФН типа I регулирует эту активность в В-клетках рыб.Наконец, тот факт, что несколько генов mx индуцируются в B-клетках в ответ на rIFNa, указывает на эффект, ограничивающий способность вирусов реплицироваться в B-клетках. Наши результаты предоставляют дополнительные доказательства взаимодействия между цитокинами врожденной иммунной системы и клетками адаптивной иммунной системы, что является важным фактором в регуляции иммунного ответа.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, доступны по запросу соответствующему автору.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено этическим комитетом INIA.

Авторские взносы

TW продуцировал рекомбинантные IFN. OB провела и проанализировала все эксперименты с помощью IS и PD-R. EM поддерживал все эксперименты по проточной цитометрии и выполнял сортировку клеток. CT задумал работу и спланировал эксперименты с помощью TW, CS, OB и PD-R и написал основную часть статьи с участием всех других авторов.Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом (ERC Consolidator Grant No. 2016 725061 TEMUBLYM), Министерством науки, инноваций и университетов Испании (проект AGL2017-85494-C2-1-R) и Comunidad de Madrid. (грант № 2016-T1 / BIO-1672).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Люсии Гонсалес и Дайане Мартин за техническую поддержку.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.01494/full#supplementary-material

Список литературы

1. Манри Дж., Лаваль Дж., Патин Э., Форнарино С., Итан Й., Фумагалли М. и др. Эволюционное генетическое вскрытие интерферонов человека. J Exp Med. (2011) 208: 2747–59. DOI: 10.1084 / jem.20111680